张建明，邓艳琴，王灵岚，林代华，杨秀惠，严延生

狂犬病是一种危害严重的自然疫源性疾病，广泛流行于世界各地，全球每年约有55 000人死于狂犬病，尤其在大量家犬任意放养的亚非等发展中国家，狂犬病发病率居高不下[1]。Pasteur于1885年首次分离出狂犬病毒(rabies virus，RV)[2-3]。1988年Tordo等[4-5]首次完成了狂犬病毒PV株的全基因序列测定。随后的研究中证实，不同地区不同宿主动物的街毒株之间存在不同的基因亚型[6-7]。因此，分离各地自然界中流行的狂犬病毒街毒株，为研究遗传变异规律积累理论资料意义重大。2000-2007年福建省狂犬病疫情呈现快速上升趋势，2008年以来，在开展科学调查的基础上实施加强基层技术人员的专项培训、规范狂犬病暴露预防处置门诊的建设、加强宣传教育、强化家犬免疫、消灭传染源等一系列综合防治措施后，狂犬病发病率逐年下降[8]。但福建省狂犬病相关的实验室基础研究仍较薄弱，未见狂犬病街毒株分离的报道。本研究从福建省一伤人的可疑狂犬中分离出狂犬病毒街毒株，证实福建省家犬中存在狂犬病毒的流行，为防治工作提供依据。

1 材料和方法

1.1标本来源 收集来自福建省内主动攻击人的疑似狂犬的脑组织标本，无菌采集病犬脑组织作为病毒分离材料，置-70 ℃保存。

1.2细胞株和单抗 BHK-21细胞株由福建省疾病预防控制中心保存。抗狂犬病毒单克隆荧光抗体由中国疾病预防控制中心病毒所惠赠。

1.3实验动物 健康昆明系普通级乳鼠(1～2 d龄)，普通级小鼠(10 g左右)由福建省疾病预防控制中心实验动物中心提供。

1.4犬脑组织标本的处理 无菌取出发病犬脑组织，一部分脑组织冷冻保存，一部分脑组织加入到玻璃研磨器中研磨，用含有双抗(青霉素1 000 u/mL，链霉素1 000 μg/mL)的PBS制成30%悬液(w / v)，4 ℃静置2 h后，4 ℃离心(3 000 r/min)20 min，取上清，移入灭菌试管中，-70 ℃保存作为接种材料。

1.5病毒分离法 采用乳鼠脑接种(Mouse InoculationTest，MIT)和细胞培养(Cell-culture Isolation Techniques，CIT)分离狂犬病毒，具体操作参照文献[9]。

1.6RT -PCR检测病毒核酸 参考《全国狂犬病监测方案》[10]中狂犬病实验室检测技术指南中提供的引物，由TaKaRa公司合成引物N1(5′-TTTGAGACTGCTCCTTTT-3′)、N2(5′-CCCATATAGCATCCTAC-3′)，操作参照TaKaRa 公司one step RT-PCR试剂盒说明书进行。

1.7病毒生物学特性研究 病毒感染力的滴定(TCID50的测定)及LD50的测定，参考文献[9-11]进行。

2 结 果

2.1直接免疫荧光法(FAT)检测脑组织 采集获取可疑狂犬的脑组织，制作印片，冷丙酮固定，染色后镜检。在荧光显微镜下我们首先找到细胞，在细胞浆内可以看到被染成鲜亮的苹果绿色或黄绿色的特异性荧光染色杜，有圆形、椭圆形、点状等多种形态，大小不一，有实体感。脑组织各部位的荧光量相当，没有显著差异(图1B)。

2.2MIT法分离病毒 乳鼠在接种犬脑组织悬液后，第11 d开始发病，表现出典型的狂犬病临床症状，哺乳能力减弱，发病初期，肌肉震颤，步样失调，之后，表现后肢运动障碍，行走时抱腿，最后全身麻痹而死亡，第13 d所有接种发病犬脑组织悬液的乳鼠均死亡。对照乳鼠无明显发病症状或死亡。小鼠的脑组织作FAT检测，视野内可见大量高密度绿色荧光颗粒和沙粒样荧光物(图1D)。将发病小鼠的脑组织悬液接种新一批乳鼠后，第8 d乳鼠出现典型的狂犬病症状，并开始死亡。

2.3CIT法分离病毒 犬脑组织悬液上清接种

图1犬和鼠脑组织FAT检测结果(×100)

Fig.1FATtestresultsofdogandratbraintissues

A: Normal dog brain tissues; B: Rabid dog brain tissues; C: Normal rat brain tissues; D: Rabid rat brain tissues.

BHK-21细胞，连续传代4代(每代4 d)，每次传代前均收集部分细胞进行FAT检测，检测结果如图2所示，由图可看出从病毒接种后8～16 d均可在BHK-21细胞胞浆内看到由狂犬病毒所产生的特异性包涵体荧光灶，随着传代次数的增加，被感染细胞比例逐渐提高，绿色荧光也逐渐增强。

图2病毒在BHK-21细胞中的FAT检测结果与增殖(×400)

Fig.2ResultsofrabiesvirusinBHK-21byFAT(×400)

A: Negative; B: Virus inoculation 8 days; C: Virus inoculation 12 days; D: Virus inoculation 16 days.

2.4RT-PCR法鉴定狂犬病毒 以犬脑组织标本提取的病毒RNA为模板，以N1、N2为引物，用RT-PCR法常规扩增核蛋白(N)基因的保守区域目的基因，经1%琼脂糖电泳检测均可得到特异的与预期片段大小(443 bp)一致的基因片段，结果见图3。核酸扩增的序列(参见GenBank登陆号：FJ866835)与GenBank数据库中已公布的狂犬病毒株序列比对，与多数毒株的核苷酸同源性大于80%，证实是狂犬病毒。

图3病毒RT-PCR扩增结果

Fig.3ResultsofRT-PCR

M: DNA Marker (DL2000); 1: PCR product (443 bp); 2: Negative.

2.5BHK-21细胞病毒液的TCID50测定结果 本研究分离的街毒在BHK-21细胞连续传代，取第四代进行病毒液感染力的测定，荧光检测结果见表1。根据Kärber公式计算：Log TCID50=-1-1×(4.375-0.5) =-4.875，得TCID50为104.875/100 μL。

表1 病毒TCID50测定结果

2.6病毒脑组织悬液LD50测定结果 取第2代发病死亡的乳鼠脑组织，研磨制成悬液，按10倍倍比稀释，接种10 g左右的小鼠，小鼠死亡情况见表2。根据Kärber公式计算：Log LD50=-1-1×(4.85-0.5) =﹣5.35，得Log LD50= 105.35即每0.03 mL的30%脑组织病毒悬液中含有105.35个Log LD50。

3 讨 论

狂犬病在临床上常因个体差异而表现各异，需要进行病原的检测和实验室诊断。FAT方法[11]是狂犬病抗原实验室诊断最常用、最精确、快速和最可靠的方法。MIT法[12]是最早应用于狂犬病毒检测与分离的一种经典方法，本方法的特点是敏感，准确性较高，试验要求不高，适于不具备组织培养条件的实验室分离狂犬病毒街毒；但是周期长，仅凭动物发病症状不足以确诊，常常需要配合免疫荧光法作特异性鉴定。CIT法的特点是敏感，周期短，成本低，需在具备组织培养条件的实验室中进行，适合样本量较大时的检测；但同样也需配合免疫荧光进行特异性诊断，样品严重污染细菌或腐败致使样品中病毒失活，会导致分离病毒失败。RT-PCR法的特点是敏感、特异、结果可靠，节省时间，在3 h内便可以得出结果，适合用于临床确诊。RT-PCR法也可以检测腐败组织里的狂犬病毒。但是，RT-PCR对内外环境要求严格，外部环境要求洁净的空气、一次性用品，内部环境要求PCR仪器内反应温度均一，同时，要想扩增成功取样必须准确。

表2 乳鼠脑接种病毒分离试验结果

理论上鸡胚纤维母细胞、地鼠肾细胞及BHK-21、Vero等传代细胞均可用于狂犬病毒的分离培养[9]，但不同的狂犬病毒街毒株在细胞培养中的分离和生长特性等生物学特性不同。本研究采用BHK-21细胞进行病毒分离，TCID50测定结果显示细胞毒滴度水平较低，所分离的街毒株对细胞的适应性有待加强，在接毒量少、培养时间短的情况下，病毒不能完全适应细胞并在细胞中繁殖。

本研究从狂犬的脑组织标本接种细胞培养物中分离出狂犬病毒样病毒，综合MIT、FAT、RT-PCR与核酸测序结果，表明分离的病毒为狂犬病毒。从福建省家犬中成功分离到狂犬病毒，证实福建省家犬中存在狂犬病毒的流行，也为福建省狂犬病毒的分子生物学研究及狂犬病的防制奠定基础。

参考文献：

[1]Morters MK, Restif O, Hampson K, et al. Evidence-based control of canine rabies: a critical review of population density reduction[J].J Anim Ecol, 2013, 82(1): 6-14. DOI: 10.1111/j.1365-2656.2012.02033.x

[2]Crick J. Rabies since Pasteur[J]. Vet Rec, 1985, 116(17): 478-479. DOI: 10.1136/vr.116.17.478-a

[3]Drazan J. 100 years since the first vaccination against rabies[J]. Vet Med (Parha), 1985, 30(9): 513-514.

[4]Tordo N, Poch O, Ermine A, et al. Completion of the rabies virus genome sequence determination: highly conserved domains among the L (polymerase) proteins of unsegmented negative-strand RNA viruses[J]. Virology, 1988, 165(2): 565-576. DOI: 10.1016/0042-6822(88)90600-9

[5]Ermine A, Tordo N, Tsiang H, et al. Rapid diagnosis of rabies infection by means of a dot hybridization assays[J]. Mol Cell Probes, 1988, 2(1): 75-82. DOI: 10.1016/0890-8508(88)90046-1

[6] Yousaf MZ, Qasim M, Zia S, et al. Rabies molecular virology, diagnosis, prevention and treatment[J]. Virol J, 2012, 21(9): 50. DOI: 10.1186/1743-422X-9-50

[7]Xu GL, Li K, Wu J, et al. Sequence analysis of N gene among 19 rabies virus street isolates from China[J]. Chin J Virol, 2002, 18(1): 48-51. DOI: 10.3321/j.issn:1000-8721.2002.01.008 (in Chinese).

徐葛林, Li Ku, 吴杰, 等. 中国19个狂犬病毒街离分离株N基因的序列分析[J]. 病毒学报, 2002, 18(1): 48-51.

[8]Zhang JM, Yan YS, Wang LL, et al. Effect analysis of comprehensive measures for rabies control and prevention in Fujian province[J]. Chin J Epidemiol, 2012, 33(7): 757-758. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2012.07.027 (in Chinese)

张建明, 严延生, 王灵岚, 等. 福建省综合防治措施控制狂犬病疫情效果分析[J]. 中华流行病学杂志, 2012, 33(7): 757-758.

[9]Xie SH, Shi XS, Wang XJ, et al. Manual of rabies prevention and control[M]. Sichuan: Science and Technology Press, 2003: 130-136. (in Chinese)

谢世宏, 史秀山, 王显军, 等. 狂犬病防治手册[M]. 四川: 科学技术出版社, 2003: 130-136.

[10]Chinese Ministry of Health. National rabies surveillance program(trial)[R]. Attachment 2, 2005: 143-144. (in Chinese)

中华人民共和国卫生部. 全国狂犬病监测方案(试行)[R].附件2, 2005：143-144.

[11]Meslin FX, Kaplan MM, Koprowski H. Laboratory techniques in rabies[M]. 4th ed, Geneva: WHO. 1996: 88-95.

[12]Webster WA, Casey GA, Charlton KM, et al. The mouse inoculation test in rabies diagnosis: early diagnosis in mice during the incubation period[J]. Can J Comp Med, 1976, 40(3): 322-325.