郑 斌，尹志奎，姚志军，张海珠，任红斌，詹希美

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii,Tg)为人兽共患弓形虫病(Toxoplasmosis)的病原体。虫体感染宿主时，主动入侵宿主细胞，并在细胞内发育、增殖[1]。微线体蛋白(microneme protein, MIC)是由弓形虫顶端胞器微线体分泌的一类蛋白，在虫体入侵细胞时发挥重要功能[2]。研究发现部分敲除MIC2后，虫体的粘附和入侵能力下降了78%[3]。MIC2为Ⅰ型跨膜蛋白，位于胞外的氨基端(N端)识别、粘附宿主细胞；位于胞内的羧基端(C端)和醛缩酶相互作用，由醛缩酶介导与虫体的肌动蛋白-肌球蛋白动力系统偶联[4]。本研究对弓形虫MIC2与醛缩酶的作用位点进行了探讨，旨在为揭示MIC2的生物学功能和弓形虫的入侵机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1弓形虫虫株、质粒和主要仪器 弓形虫强毒株(RH株)和原核表达载体pGEX-4T-1由中山大学中山医学院寄生虫学研究室传代保种。蛋白电泳及电转移装置(Mini-PROTEIN 3 Cell)为Bio-Rad公司产品；核酸蛋白质分析仪(BeckmanDU640)为Beckman公司产品。

1.1.2主要试剂EcoRI 和SmaI 限制性内切酶为NEB公司产品；GST pull-down用sepharose(Glutathione sepharoseTM4B)、GST融合蛋白亲和纯化柱(GSTrap FF)购自Amersham Biosciences公司；硝酸纤维素膜(NC)为PALL公司产品；免疫印迹增强化学发光法(ECM)试剂盒(兔IgG)购自Promege公司；X感光胶片为Kodak产品；显影液和定影液购自武汉博士德公司；GST-MIC2C蛋白和抗醛缩酶多克隆抗体(anti-aldolase)为本研究室前期制备[5-6]。

1.2实验方法

1.2.1MIC2C W/A/pGEX-4T-1重组原核表达系统的构建 根据报道的弓形虫RH株MIC2的基因序列(U62660)[7]，将MIC2 C端767位色氨酸(W)突变为丙氨酸(A)，设计1对特异性引物并合成(上游引物：5’-GAACCCGGGAGTTACCACTACTATTTGAGCTC-3’，下游引物：5’-GGGGAAT

TCCTACTCCATCGCCATATCACTATCGTC-3’，其中CCCGGG为SmaI 酶切位点，GAATTC为EcoRI 酶切位点)。按照文献[8]的方法完成MIC2C W/A基因片段的PCR扩增及MIC2C W/A/pGEX-4T-1重组原核表达系统的构建。

1.2.2GST-MIC2C W/A突变体融合蛋白的制备 GST-MIC2C W/A突变体融合蛋白的诱导表达、纯化及蛋白浓度分析具体操作见文献[8]。

1.2.3GST pull-down实验鉴定蛋白作用位点 制备新鲜弓形虫速殖子裂解液，分别以GST-MIC2CW/A突变体蛋白和GST-MIC2C蛋白(阳性对照)作为探针蛋白与弓形虫速殖子裂解液进行pull-down实验，具体操作见文献[9]，实验产物常规处理，SDS-PAGE及Western blot分析。

2 结 果

2.1弓形虫MIC2C W/A突变体基因片段的PCR扩增 以弓形虫cDNA第1链为模板，PCR扩增MIC2CW/A基因片段，1.5%琼脂糖凝胶电泳。结果显示在100～200 bp之间有一条带，与目的基因片段大小相符(图1)。

图1MIC2CW/A基因片段PCR产物

Fig.1PCRproductsofMIC2CW/Agenefragment

M: 100 bp DNA ladder；1-2: PCR products of MIC2C W/A gene fragment.

2.2GST-MIC2C W/A融合蛋白的表达 37 ℃，IPTG 1 mmol/L的条件下诱导表达GST-MIC2C W/A融合蛋白，SDS-PAGE分析(图2)。结果显示在诱导1～7 h均有目的蛋白表达(箭头示)。大量摇菌，诱导表达目的蛋白，GSTrap FF纯化融合蛋白，核酸蛋白分析仪分析GST-MIC2C W/A突变体蛋白的浓度为2.55 mg/ml。

图2GST-MIC2CW/A融合蛋白表达条件的优化

Fig.2OptimumconditionfortheexpressionofGST-MIC2CW/Afusionprotein

M: Protein molecular weight marker; 1-4: MIC2C W/A/pGEX-4T-1/BL21 induced by IPTG 7, 5, 3, and 1 h respectively; 5: MIC2CW/A/pGEX-4T-1/BL21 uninduced; 6: pGEX-4T-1/BL21 induced by IPTG 7 h; 7: BL21 induced by IPTG 7 h.

2.3GST pull-down产物的SDS-PAGE及Western blot分析 以GST-MIC2C W/A蛋白为探针蛋白，与弓形虫速殖子裂解液进行pull-down实验，实验产物常规处理。以GST-MIC2C蛋白与弓形虫速殖子裂解液进行pull-down实验的产物为对照，共同进行SDS-PAGE和Western blot分析(图3)。结果表明GST-MIC2C蛋白的pull-down产物中可见一蛋白条带，可被醛缩酶抗体(anti-aldolase)识别，而GST-MIC2C W/A蛋白的pull-down产物中则未见蛋白条带。

图3GSTpull-down产物的SDS-PAGE和Westernblot分析

Fig.3SDS-PAGEandWesternblotanalysisofproductsfromGSTpull-downexperiment

M: Protein molecular weight marker; 1:T.gondiilysate; 2: The products of GST-MIC2C protein pull-down; 3: GST-MIC2C protein; 4: The products of GST-MIC2C W/A protein pull-down; 5: GST-MIC2C W/A protein.

3 讨 论

伯氏疟原虫的血小板反应蛋白相关未知蛋白(Thrombospondin-related anonymous proteins, TRAP)和环子孢子蛋白TRAP相关蛋白(CS protein-TRAP-ralated protein, CTRP)C端的色氨酸(W)对应密码子的碱基突变后，疟原虫的子孢子和动合子则不能运动，而且失去入侵宿主细胞的能力[10-12]。Clustalw对比分析疟原虫TRAP、CTRP和弓形虫MIC2的C端序列，结果提示蛋白C端的色氨酸(W)为保守氨基酸(图4)，由此推测弓形虫MIC2 C端的W可能为其关键氨基酸位点。

图4弓形虫MIC2、恶性疟原虫CTRP和TRAP蛋白序列的对比分析

Fig.4ProteinsequencealignmentofTgMIC2,PfCTRPandPfTRAP

体外定点突变技术是研究基因和蛋白质结构、功能的重要技术[13-14]。利用该技术，弓形虫致密颗粒蛋白(dense granule proteins，GRAs)在蛋白切割中的作用及抑制蛋白(profilin)β-hairpin的功能得以揭示[15-16]。常用的定点突变方法有盒式突变、寡核苷酸引物介导的定点突变及PCR 介导的定点突变等。定点突变技术多用于单个或几个核苷酸的变异，若需要变异多个核苷酸或对基因组进行编辑、修饰等，则采用锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease, ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)等技术[17]。已经运用TALENs对线虫的基因组进行了定点编辑，弓形虫基因组的编辑、修饰还未见报道[18]。本研究采用核苷酸引物介导的突变方法将MIC2的W突变为A。用制备的GST-MIC2C W/A突变体蛋白作为探针蛋白与弓形虫裂解液进行GST pull-down实验，GST-MIC2C蛋白为对照，结果显示GST-MIC2C W/A突变体蛋白不能沉降弓形虫裂解液中的醛缩酶蛋白，即当W变为A时，MIC2C与醛缩酶之间的相互作用消失，从而证明W为两蛋白的相互作用位点。

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