杨秀惠，蔡少健，张红榕，何爱华，吴瑞红，林志强，严延生

福建省急性弛缓性病例(acute flaccid paralysi, AFP)监测系统，建于1992年，以及时发现本土及输入性脊髓灰质炎(脊灰)病例。按照《全国急性弛缓性麻痹(AFP)病例监测方案》开展监测[1]。运行20年来，各项指标均达到WHO要求，维持着高敏感性，积累了丰富的流行病学、临床及病毒学的资料。1994年我国分离出最后1例脊灰本土野病毒后，福建省AFP病例中非脊灰肠道病毒(Non-Polio Enterovirus, NPEV)的分离率超过了脊灰疫苗株病毒，NPEV引起的类脊灰样病例成为AFP病例主要部分[2]。由于EV71和脊灰病毒一样能感染脊髓前角细胞[3]，因此在实现无脊灰后成为AFP病例重要病原体之一[4]。本文特分析福建省EV71相关的AFP病例流行病学、临床及病原学资料，探讨EV71流行趋势及病原变异的规律等。

1 材料与方法

1.1资料与数据 AFP病例相关流行病、临床及实验室检测结果来源于福建省AFP监测系统资料。

1.2病毒分离与鉴定 根据WHO《脊髓灰质炎实验室检测手册》(第4版)进行细胞培养、病毒分离及鉴定，分离病毒株均保存在-20 ℃以下。对非脊髓灰质炎病毒应用EV71-A和EV71-S引物进行EV71的RT-PCR诊断。

1.3EV71 VP1基因序列测定与分析 对EV71诊断阳性的分离株，用EV71F1-2372和EV71R1-3454引物[3]RT-PCR一步法扩增VP1基因全长，扩增的体系50 μL/份，其中病毒RNA 5 μL，10×缓冲液5 μL，dNTP(各2.5 mmol/L)5 μL，MgCl2(25 mmol/L)10 μL，AMV、RNA酶抑制剂(RNasin)及ExTaq各1 μL，上下游引物(20 μmmol/L)各1 μL，最后用去离子水补到50 μL。50 ℃45 min逆转录，94 ℃ 5 min变性后转入PCR扩增(94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min循环35个)，最后延伸72 ℃ 10 min。PCR扩增产物委托上海生物工程公司进行纯化及测序。

序列结果用Sequencher、Bioedit进行校对编辑，应用Clustalx(1.83Version)进行序列比对，应用Mega(14.0.0.162Version)中Kimura2-Parameter模型，Bootstrap 重复500次计算遗传距离及标准差并构建系统发生树，氨基酸同源性应用P-distance模型，Bootstrap 重复500次计算。

除福建株外，从GenBank下载了EV71各基因型及亚型代表株和2008年安徽阜阳代表株同时进行分析。

1.4统计分析 应用EXCEL(2003)构建EV71相关病例的数据资料库，应用SPSS进行统计学分析。

2 结 果

2.1发病情况 2003-2012年6月，福建省15岁以下儿童AFP病例报告率均在1/10万以上，所有病例均采集粪便标本进行病毒分离，87%以上病例均在麻痹14 d内采集双份合格标本，对不合格粪便标本的高危病例须增采5例周围健康接触者粪便标本，以维持较高的监测敏感性。

2.2流行病学特征 2007年及2012年从3例AFP病例的健康接触者分离到EV71病毒株。25例EV71阳性分离者，分别来自福建省的9个设区市；52%(13例)病例发病时间为5-6月；男童15例，女童10例，性别比为3∶2；年龄为3.5月～6.4岁，3岁以下有19例,见表2。

2.3临床表现及预后 90.91%(20/22)的病例在麻痹前均有发热表现，但麻痹时仍伴有发热63.64%(14/22)。14例为单侧肢体瘫痪，仅1例四肢同时受累，54.55%(12/22)病例肌力为4级及以上(虽有下降但仍能抵抗外力运动)。麻痹60天后随访发现2例(9.09%)残留麻痹，2008年(P08-74)和2012年(P12-123)各1例，其中P08-74病例右下肢肌力从发病时0级改善到3级，P12-123病例为左下肢麻痹，随访时肌力无明显改善，维持在1级；且此2例均在麻痹前约1周出现过典型的手足口病表现。其他20例中3例在个案调查及随访时提到麻痹前曾出现过典型的手足口病表现。

2.4病原学特征 22例AFP病例分离株及3例

表1 福建省AFP病例中EV71分离情况及发病率

表2 EV71与AFP病例的相关情况

Note: a--Laboratory number is year + sequence number; b--M=male, F=Female; c: 0=complete paralysis, 1=flicker of contraction present, 2=active movement with gravity eliminated, 3=active movement against gravity, 4=active movement against gravity and some resistance described as poor, fair, and moderate strength, 5=normal power; *indicated the patients had residual paralysis.

AFP病例健康接触者分离株均属于EV71 C4基因型，除2003年分离株为C4b基因亚型外，2004年以来的分离株均为C4a,见图1。

从核苷酸序列同源性比较显示，与2003年分离株相比，序列差异性随着年度变迁呈上升趋势(表3)，表明病毒在不断进化。2004-2008年福建省分离株与其它年份分离株核苷酸差异性在3.31%～5.68%；同一年度内分离株间差异性也较高(3.83%～4.33%)，在遗传树图中(图1)2006年、2007年和2008年的分离株呈散在分布于不同的分支下；与2008年安徽阜阳代表株(EU703813-Fuyang-2/AH/ CHN/2008)相比，核苷酸差异性为2.78%～4.20%。 2009-2012年分离株间核苷酸差异性<3.18%(2.31%～3.18%)，与2008年阜阳代表株平均差异性均小于2%(1.39%～1.90%)；提示2009年前福建流行株具多种来源途径，呈散在非流行态势，而2009后病毒株可能来源于2008年安徽阜阳，并呈流行态势。尤其值得关注的是，2012年流行株与其它年份的分离株均存在较大的差异性(>2.75%)。

图1福建省2003-2012年AFP相关的EV71病毒遗传树

Fig.1PhylogeneticanalysisbasedonVP1geneoftheEV71associatedwithAFPcases

表3不同年度分离株间核苷酸与氨基酸序列平均差异性比较(%)

Tab.3Comparisonofthemeandifferencesinthenucleotideandaminoacidsequences(%)betweenstrainsisolatedindifferentyears

200320042006200720082009201020112012FY2003/0.34 1.12 1.01 1.18 0.88 0.84 0.81 1.01 0.67 20046.81 /0.79 0.67 0.84 1.08 1.01 1.18 1.35 1.01 20067.70 3.60 3.89(0.90)0.67 0.79 0.90 0.90 1.40 1.23 0.90 20077.58 3.65 3.51 3.83(0.67)0.59 0.77 0.67 1.09 1.01 0.67 20088.17 4.20 3.69 3.31 4.33(0.67)0.74 0.67 1.18 1.01 0.67 20098.05 4.40 3.93 3.39 3.45 2.27(0.47)0.40 0.77 0.61 0.27 20108.39 4.90 4.22 3.46 3.64 2.31 2.33(0.34)0.67 0.51 0.17 20118.35 5.18 4.90 4.21 4.57 2.65 2.69 2.76(1.01)0.84 0.51 20128.96 5.68 5.09 4.41 4.65 3.00 2.75 3.18 2.81(0.67)0.34 FY7.89 4.20 3.38 2.78 3.01 1.39 1.23 1.71 1.90 /

Note: The upper right region is the difference in the amino acid sequence; the lower left region is the difference in the nucleotide sequence; the intermediate italics are the differences in the nucleotide (amino acid) sequence within the same year. FY is the representative strain of Fuyang isolated in 2008 (EU703813 -Fuyang-2/AH/CHN/2008).

3 讨 论

EV71是小RNA病毒科肠道病毒属中的一员，是手足口病常见的病原体。EV71感染以典型的手、足、口等部位皮肤、黏膜的损伤为主要临床表现，部分严重病例合并神经系统的侵害，表现为脑膜脑炎、脑炎、急性弛缓性麻痹等。在EV71引起急性神经系统感染病例中，急性弛缓性麻痹(AFP)症状发生率在不同暴发事件中大不相同：1975年保加利亚暴发中为7.4%[5]，1978年匈牙利为4%[6]，1985--1989年美国暴发中为9%[7]，1988-1990年巴西暴发为58%[8]，1998年台湾暴发中为9.8%[9]。2008年安徽阜阳暴发EV71引起的手足口病暴发流行，3-5月报告病例中合并神经系统感染重症病例占6%[10]，但AFP病例发生率未见报告。2008-2010年中国其他省市不同医院报告的合并急性神经系统感染HFMD病例中，AFP发生率为4.9%～42.9%[11-15]。

福建省AFP病例监测系统自建立以来，年报告发病率始终高于1/10万，流行病及时调查率、合格标本采集率和及时分离率等均超过90%，非脊灰肠道病毒分离率达到8%以上，说明该监测系统始终保持较高的敏感性和及时性。AFP病例中EV71病毒分离阳性率在2008年后呈上升趋势，2008-2012年6月EV71分离阳性率2.39%(17/712)，比2003-2007年0.59%(5/850)增加了3倍。EV71相关的AFP发病率显著上升，到2012年上半年达到近1/100万(9.82/1000万)，反映了福建省2008年后AFP病例中EV71的感染率高于2008年之前。AFP病例监测系统所采标本均为粪便标本，虽无法确定AFP发病与EV71之间的病因学关系，但AFP病例的感染率状况仍可从一个侧面反映了EV71的流行强度，可见福建省2008年以来EV71流行强度呈上升趋势，这与2008年以来福建省手足口病例监测结果相一致，因此已建立20多年的AFP监测系统可做为EV71流行强度的补充监测手段之一。

22例EV71感染病例中，5例有报告麻痹前有手足口病典型表现，其他病例除因AFP病例个案调查表及随访表未提及此项内容，家属也未给予补充外，也可能确实无典型手足口病表现。90.91%的病例麻痹前有发热，以单侧肢体麻痹为主(63.64%，14/22)，肌力以4级及以上为主(54.55%，12/22)，2例残留麻痹。虽有报道认为EV71引起的AFP病例愈后好于脊灰病毒[4]，但9.09%的残留麻痹率仍需引起重视，尤其是P12-123病例虽经规范治疗，但60 d随访时麻痹肢体肌力仍无明显改善。

由于中国大陆自2008年5月才开始建立手足口病监测系统，而之前无系统的监测数据阐析EV71在中国的流行趋势和病毒变异特征，AFP监测数据资料和病毒库正可弥补这方面的不足。通过对2003年以来福建省AFP病例中分离的EV71分析，可以明显地看出，2008年之前EV71相关病例较少，处于非流行态势，且有多传播链来源病毒共循环；2008年之后病毒来源较单一，且AFP病例分离株与HFMD病例分析高度同源，呈流行态势，2012年病毒株又开始出现新的变化，可预测2012后福建省EV71流行将发现改变。因此通过AFP病例监测系统可以大略反映EV71的流行趋势。

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