赏 楠

(辽宁中医药大学附属医院心内VIP科,沈阳 110032)

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增生是动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)病变的关键，是心血管疾病药物治疗的靶细胞之一，所以研究VSMC增生的机制,已经成为研究As发病机制的一个关键。血管狭窄的细胞学基础是血管中膜的平滑肌细胞向内膜迁移并增生转型，引起血管内膜增生，因此若能控制VSMC增殖可以实现抑制血管内膜增生，从而阻止血管狭窄。血小板源性生长因子-B(platelet-derived growth factor-B,PDGF-B)的表达及低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein -cholesterol，LDL-C)的水平与VSMC增殖密切相关。本研究建立大耳白兔As模型以反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法检测PDGF的水平及生化方法观察LDL-C的水平，观察中药方剂对引起血管狭窄因素的抑制水平,即中药方剂抑制LDL-C的水平及PDGF-B的表达，从而验证中药方剂对As的抑制水平。

1 材料与方法

1.1实验材料 动物:选取2～3月龄大耳白兔32只，体质量为2.2～2.6 kg，由辽宁中医药大学动物实验中心提供。不分雌雄、体质量、月龄，随机分为正常对照组、模型组、西药组、中药组四组，每组8只，分笼饲养。高脂饲料:配方(质量分数)采用15%蛋黄粉+5%猪油+1%胆固醇+基础饲料(基础饲料、蛋黄粉、猪油及胆固醇均购于辽宁中医药大学附属二院动物实验中心)。药品:理气活血汤的组成为柴胡25 g、益母草25 g、川芎 25 g、香附25 g、当归25 g(以上药物煎煮成30 mL汤药)。氟伐他汀胶囊，40 mg/粒(北京诺华制药有限公司,国药准字：H20010518)。

1.2实验试剂及器材

1.2.1RT-PCR试剂 RNA提取试剂(Trizol)(invitrogen公司生产，批号：1203406)，异丙醇(宝生物工程大连有限公司生产，批号：0980507)；氯仿(宝生物工程大连有限公司生产，批号：20010401)；焦碳酸二乙酯(DEPC)(宝生物工程大连有限公司生产，批号：BBI0916S03)；DNA-marker DL2000(宝生物工程(大连)有限公司生产，批号：CB3301)；RT-PCR试剂盒(宝生物工程大连有限公司，批号：BK2201)。

1.2.2仪器和设备 2.5～3.0 mm球囊导管及导丝、PCR仪(PE-9600美国)、离心机(德国Heittich Roto Silenta 600RS)、贝克曼700型全自动生化仪等。

1.3实验方法 正常对照组给予基础饲料，西药组、中药组、模型组均予以高脂饲料；而西药组和中药组则在喂饲高脂饲料的基础上分别加用氟伐他汀胶囊和理气活血汤，每日给药一次(其中氟伐他汀胶囊用量为10 mg/只，将理气活血汤组成的重要煎煮成30 mL，分三日口服，10 mL/d/只灌胃)用量参照文献[1]计算。各组动物每日限食100～120 g，自由饮水。实验第5周，西药组、中药组和模型组均行右侧腹-髂动脉内膜球囊损伤术，方法为：右侧大腿内侧股动脉搏动处最明显处局部麻醉，切开皮肤，逐层分离，暴露并游离股动脉，于股动脉前壁剪开一小口，依次送入导丝针和软头导丝，并沿导丝导入球囊导管，以0.09%盐水扩张球囊压力，并阻抗力回拉至股动脉，抽空球囊，再插入球囊扩张，如此重复三次，充分剥脱腹髂动脉内膜，术毕取出球囊和导丝，逐层进行缝合，术后第3日开始每日肌内注射庆大霉素8万U抗感染，创面局部喷散庆大霉素8万U防止感染，术区切口仅2 cm，损伤较小。以上各组试验时间均为8周，造模后大耳白兔未见明显异常。实验第8周，实验结束，于耳缘静脉采血后处死大耳白兔，保留大耳白兔腹主动脉以便进一步观察动脉变化。将兔血清离心分离，利用贝克曼700型全自动生化仪及LDL-C配套试剂盒以匀相测定法测定LDL-C，用RT-PCR方法观察PDGF-B的表达。

2 结 果

2.1LDL-C的变化 模型组的LDL-C水平高于正常组(P<0.05)；中药组和西药组的差异无统计学意义(P>0.05)；西药组、中药组LDL-C水平均低于模型组(P<0.05)(表1)。

2.2RT-PCR结果 从色带的明暗度上可以看出，模型组的PDGF-B的表达较强，色带较亮，其次为正常组，再次为西药组，最弱为中药组(图1)。模型组表达高于中药组和西药组(P<0.05)，而中药组和西药组PDGF-B的表达差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表1 四组大耳白兔LDL-C水平的对照

图1 RT-PCR方法检测PDGF-B的表达

表2 四组大耳白兔PDGF-B对照 (mg/L)

3 讨 论

随着心血管诊疗水平的不断进展，心脏介入手术被更多的人所接受和认可，怎样预防介入后再狭窄的问题成了心内科医师所面临的新挑战。本实验通过球囊损伤血管内膜加高脂饮食成功建立了As及再狭窄的实验模型。近年来血脂异常以及As发病年龄越来越低，发病机制呈现出由虚转实的趋势。肝失疏泄从而导致气机不畅、气滞血瘀、瘀血内停，成为导致As发病的又一病机。所以本方采用疏肝理气，活血化瘀的治疗方法，通过现代科学技术手段，印证理气活血方剂对As病变的防治效果。本实验研究结果显示,中药组大耳白兔LDL-C和PDGF-B含量显著低于模型组，而中药组和西药组无明显差异。以上实验结果说明理气活血中药方剂与氟伐他汀胶囊具有相对一致的作用，能够有效降低血脂、减少造成血管内皮细胞增生的PDGF-B的表达。

本方中柴胡的有效成分柴胡皂甙具有降低血浆LDL-C和降低兔血压的作用。有实验证明，以柴胡为主的大柴胡汤可以改善高脂血症所致的动脉内皮和平滑肌损伤[2]，可抑制血小板聚集，具有甾体和非甾体双重抑制作用，抑制前列腺H2的合成[3]；同时可以减少As模型主动脉内膜脂质斑块面积及斑块厚度，显著减轻VSMC的增生。当归中所含的阿魏酸及多糖成分是被较早提取出来的当归有效成分，明显改善血脂，降低LDL-C，升高高密度脂蛋白胆固醇、超氧化物歧化酶水平,显著降低大鼠主动脉组织中血管细胞黏附分子信使RNA的表达,提示当归可能有保护血管内皮细胞功能的作用,可以抑制As的发生、发展[4]。现代药理证明[5-8]，益母草的主要成分为益母草碱，水苏碱，益母草啶等成分，具有溶栓、抗凝、降脂、抗炎、改善微循环等作用。四甲基吡嗪为川芎的主要成分,为行气活血化瘀的一种中药生物活性碱,它可以增加冠状动脉血流量、降低冠状动脉阻力和降低血管外周阻力的作用[9]。

PDGF-B表达的增加，可以促使VSMC的增殖和下调VSMC的细胞分化，同时诱导间质细胞的一系列免疫反应[10]。PDGF-B在As的形成中发挥更加主要的作用，通过抑制LDL-C的受体相关蛋白6增强VSMC增殖[11]，通过蛋白酪氨酸磷酸酶减少PDGF-B磷酸化的水平来抑制VSMC的增殖和迁移，或通过异常的促炎症高密度脂蛋白作用在单核细胞上PDGF-B信号通路部分推进促As表型的研究，都从不同角度证实了PDGF在As中的作用。因此有效控制PDGF基因表达可以阻止VSMC的增殖。本实验建立实验大耳白兔高脂及腹主动脉损伤模型，同时以中药汤剂灌胃后，证明理气活血方能够抑制PDGF的表达，降低血脂，改善血管内皮细胞的增殖和转型，控制血管增生，从而控制血管狭窄。本实验结果显示中药组PDGF-B的表达低于模型组，说明该汤药方剂有可能抑制VSMC增殖，从而阻止内膜增生，达到控制血管狭窄发生发展的目的。

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