张 瑞， 王风芹， 付晨青， 宋安东

(河南农业大学 生命科学学院 农业部农业微生物酶工程重点实验室, 河南 郑州 450002)

蛋白质组学(Proteomics)是在蛋白质分离、纯化和质谱鉴定等技术相结合的基础上发展起来的一门新型学科，是对基因组学研究的补充和延伸。蛋白质组学从整体角度研究某一细胞、组织或生物体蛋白质组成及其动态变化规律，了解蛋白质之间的相互作用与联系，获得蛋白质水平上关于细胞代谢等过程的整体而全面地认识[1]，弥补了传统方法对单个基因或蛋白质研究的局限性。利用蛋白质组学技术研究微生物在发酵过程中因生长环境的改变而引起的胞内蛋白质表达谱的差异性，寻找促进细胞生长代谢和产物生产的关键蛋白，并揭示其影响机理，可以为工业发酵菌种的改良和发酵工艺的优化等提供重要的理论依据。因此，应用蛋白质组学技术研究微生物代谢与控制是微生物学研究的热点之一。

1 蛋白质组学关键技术

图1 蛋白质组学研究过程简图

蛋白质组学的迅速发展及广泛应用得益于蛋白质样品分离纯化、质谱分析及生物信息学分析等各项核心技术的支撑。各项技术的应用使得蛋白质组学研究体系更加完善，方法更加简易。蛋白质组学研究过程主要包括样品准备与预处理、样品分离(主要包括双向蛋白电泳技术、双向液相色谱、离子交换层析等)、自动化检测(质谱分析)及数据分析等过程(图1)。近年来，在蛋白质样品分离纯化(表1)及质谱分析(表2)过程中，相应研发出精度高、范围广、自动化程度高的新型技术。

表1 蛋白质分离纯化技术及其优缺点

表2 蛋白质质谱分析技术及其优缺点

双向电泳(2D-GE)是蛋白质组学研究中传统的蛋白分离纯化技术，具有分辨率高、上样量大、重复性好等优点[2]。然而，检测范围窄(8 kDa～200 kDa)、膜蛋白和极端酸性或碱性蛋白质电泳容易丢失、低丰度蛋白质(拷贝数<1000)分离不到的缺点限制了该技术的使用范围[4, 8]。同位素亲和标签(ICAT)技术可以简单且有效地对蛋白质进行标记分离，适宜于对疏水性膜蛋白、磷酸化蛋白、低拷贝蛋白质的研究[8]。然而ICAT标记的是半胱氨酸残基，不是所有蛋白质都含有半胱氨酸残基，例如酵母菌8%蛋白质未含有此基团，因此鉴定蛋白质数据的结果不可避免地存在误差。双向高效液相层析(2D-HPLC)技术与双向电泳技术具有相似的功能，主要应用于蛋白质混合物的纯化阶段，但其分离纯化效果更好。此技术应用时应注意歧视效应的现象[11]，即分流进样状态下低沸点组分测定含量偏高而高沸点组分含量偏低。蛋白质分离纯化技术的多元化发展，有益于后续对蛋白质鉴定，功能分析等研究。

质谱技术的快速革新促进了蛋白质组学研究的深入，质谱技术与各类电离子化分离技术的联用使得蛋白质组学研究更加简易。尽管在蛋白质分离方面存在差异，但是这种联用体系都具有类似的优点，如自动化程度高、灵敏性好、选择性强、检测速度快、检测范围广、检测结果精确和重复性好等[4, 6]。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾离子化-质谱(ESI-TOF-MS)是目前用于多肽和蛋白质电离、检测、分析一体化的主要质谱方法。MALDI-TOF-MS适用于大分子量(<6000 kDa)含碱性氨基酸残基(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)蛋白质，分子量过小的样品检测时容易受到基质的干扰；而ESI-TOF-MS适用于含疏水性氨基酸残基蛋白质(如膜蛋白)，但是要注意对样品溶剂的选择，另外样品溶液的一些物理因素也会限制该技术的使用[6, 8]。最近，ESI-TOF-MS技术又扩展到对用其他方法难以表征的簇合物和以氢键、范德华力等非共价键结合的超分子体系的检测。表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术是基于MALDI-TOF-MS之上建立的与蛋白质芯片联用和以亲和力为基础的质谱方法[8-9]，因为蛋白芯片的多样化设计赋予该技术宽广的检测范围(1 kDa～300 kDa)，更适用于研究超微量蛋白质、蛋白质相互作用及生物标记鉴定等方面，广泛应用于医学上对血清、尿液、组织提取物的检测。鸟枪法液相质谱(Shotgun-LC-MS)技术沿用了鸟枪法基因测序的原理，在蛋白质测序方面更加可靠，也是现行较为实用的一项蛋白质组学技术，对膜蛋白的分析效果非常好，但是对亚型蛋白质反应不敏感，导致测定结果有误差[12-13]。

2 梭状芽孢杆菌属中工业菌种种类

梭状芽孢杆菌(Clostridium)属于厚壁菌门(Firmicutes)梭菌纲(Clostridia)梭菌目(Clostridiales)梭菌科(Clostridiaceae)[14]，革兰氏阳性、可形成芽孢、粗杆或棒状、一般为专性厌氧生长。目前，梭状芽孢杆菌属有200多个种，常见的有引起肉类食品腐败的肉毒梭菌(C.botulinum)，引起人和动物病害的破伤风梭菌(C.tetani)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、艰难梭菌(C.difficile)等。能够用于工业发酵或潜在的可作为工业发酵微生物菌种的梭状芽孢杆菌主要有：用于丙酮丁醇发酵的丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、嗜糖双丁酸梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)和嗜糖丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)；能够发酵生产丁酸和1, 3-丙二醇的丁酸梭菌(C.butylicum)；微生物产氢用到的巴氏梭菌(C.pasteurianum)等。近年来，利用热纤维梭菌(C.thermocellum)发酵木质纤维素生产乙醇的研究成为纤维乙醇领域的一个研究热点。随着蛋白质组学技术的成熟与突破，对工业发酵梭状芽孢杆菌也进行了更加深入地研究，旨在为突破发酵瓶颈提高产物产量提供理论依据。

3 蛋白质组学在工业发酵梭状芽孢杆菌研究中的应用

3.1 蛋白质组学在产溶剂梭状芽孢杆菌研究中的应用

丙酮丁醇发酵过程分为产酸期和产溶剂期两个阶段，对数生长期产生有机酸(乙酸、丁酸等)；进入稳定期后，有机酸被重新吸收，产生丙酮(Acetone)、丁醇(Butanol)和乙醇(Ethanol)，又称总溶剂或ABE。学者们利用2D-HPLC-MS/MS和Shotgun-MS技术对丙酮丁醇发酵过程中丙酮丁醇梭菌产酸期和产溶剂期蛋白质谱表达差异进行了较为深入的研究，发现该菌在产酸期和产溶剂期差异表达蛋白质数目在17～44种之间[15, 17-18]，其中9～15种蛋白质在产酸期的表达量高于产溶剂期，8～29种蛋白质在产溶剂期的表达量高于产酸期。其中与溶剂产生相关的酶蛋白和新陈代谢活动调节蛋白较多，包括DnaK、GroEL、Hsp18、CAC2873、CAP0164、CAP0165、CAC3298、CAC1742、乙酸乙酰脱羧酶等[15-19]。利用SDS-PAGE、LC-MS/MS技术对产溶剂期表达量较高的蛋白质进一步分析发现，多数蛋白质存在磷酸化现象，磷酸化蛋白质可调节产酸期向产溶剂期的转变，同时直接或间接地参与了有机溶剂的产生过程[20-21]。对部分差异性表达蛋白的结构和功能进行初步功能定位，有助于将来对特定蛋白质功能的定向改造，为丙酮丁醇高产菌株的构建提供理论支撑。

对丙酮丁醇高产突变菌株的蛋白组学进行研究，可以更好地揭示微生物对丁醇耐受能力提高及产量提高的机理，为高产菌株的分子育种提供理论依据。Mao等采用MALDI-TOF-MS技术对野生型C.acetobutylicumDSM1731与其高产突变菌株Rh8在产酸期和产溶剂期的细胞质蛋白质组与细胞膜蛋白质组差异性进行了系统研究[22-23]。对比细胞质中分离出的蛋白质图谱，显示存在102个差异表达蛋白质点，主要涉及蛋白质折叠、溶剂产生、蛋白质合成、核酸代谢等相关蛋白质。还发现突变型Rh8菌株中蛋白质在产酸阶段和产溶剂阶段会出现上调(分子伴侣、产溶剂相关蛋白质)或者下调(酸代谢、蛋白质合成相关蛋白质)的现象，然而在野生型菌株中这种上调或下调的现象仅发生在产溶剂阶段。这表明突变型Rh8菌株已经进化出较高水平的代谢机制，细胞在丁醇产生前就开始准备自身对丁醇产生及其毒性的适应能力，从而使丁醇产量提高[23]。细胞膜蛋白质组谱表达差异研究共分离得到73种差异表达蛋白质点，质谱分析结果表明突变型Rh8菌株比野生型菌株进化更加高级，膜结构更加稳定、能量代谢的经济效率更高。

发酵液中丁醇的累积对产溶剂梭菌细胞产生不可逆的毒害作用，严重阻碍了细胞内丁醇的继续产生。对丙酮丁醇梭菌在丁醇胁迫环境中生长时细胞内蛋白质组对比研究显示，丁醇的存在能够抑制与产生溶剂相关蛋白质的表达，最终导致丁醇产量的下降[24]。但是，利用MALDI-TOF-MS/MS技术对拜氏梭菌C.beijerinckiiNCIMB 8052蛋白质组学研究发现，添加Ca2+能够引起拜氏梭菌胞内蛋白质组表达发生明显的改变，特别添加Ca2+后可以提高热激蛋白GrpE、DnaK等与产溶剂相关蛋白质的表达量，Ca2+以其自身的缓冲作用和对丙酮丁醇发酵过程中葡萄糖转运、丁醇耐受力和溶剂化阶段的积极影响有效地提高了ABE的产量[25]。

3.2 蛋白质组学在热纤维梭菌研究中的应用

热纤维梭菌(C.thermocellum)可有效降解木质纤维素类物质直接转化为乙醇，是纤维乙醇发酵产业中重要的一类潜在工业菌种。纤维小体(cellulosome)是一种多亚基的纤维素酶复合体，通过锚定-粘附机制附着于细胞壁上。纤维小体中的大多数蛋白质是由cip-cel操纵子区基因编码，承担细胞对纤维素的降解[26]，对热纤维梭菌蛋白质组学研究，主要集中在纤维小体蛋白质的差异性分析。使用nano-LC-ESI-MS技术对比研究热纤维梭菌在纤维素和纤维二糖基质中纤维小体蛋白质组差异，共发现了41个纤维小体蛋白质，包括36个I型含锚定结构蛋白(dockerin-containing protein)，其中有3个已知锚定成份和16个未知的新亚基。在纤维素基质中生长的纤维小体蛋白质组中蛋白OlpB、外切葡聚糖酶CelS和CelK，及水解酶第九家族的外切葡聚糖酶CelJ含量高于生长在纤维二糖基质中的蛋白含量；相反地，水解酶第八家族的外切葡聚糖酶CelA，第五家族的外切葡聚糖酶CelB、CelG、CelE，半纤维素酶XynA、XynC、XynZ和XghA含量却低于纤维二糖基质中的蛋白含量[27]。采用LC-MS/MS技术对比研究热纤维梭菌在不同基质中(稀酸预处理过的柳树枝、纤维二糖、非晶体纤维素、晶体纤维素、晶体纤维素中添加果胶或木聚糖)生长的纤维小体蛋白质发现，水解酶第九家族在微晶纤维素基质和稀酸预处理的柳枝基质中含量增高，水解酶第五家族在晶体纤维素或非晶体纤维素中含量明显增高[28]。另外，利用2D LC-MS/MS技术研究发现热纤维梭菌存在2个纤维素酶家族Cel48S和Cel48Y，细胞在晶体纤维素基质中生长，即使其中一个纤维素酶家族没有表达，晶体纤维素的降解也能继续进行[29]。总而言之，纤维小体组分的差异表达受到特殊底物的调控，以此来适应细胞对不同环境生长的需求。热纤维梭菌纤维小体组分变化的研究，有助于对纤维小体酶蛋白组分的设计和新菌种的改造，以适应一些较特殊的底物作为碳源进行乙醇发酵，促进乙醇工业化生产的进程。

此外，用nano-LC-ESI-MS/MS技术对比热纤维梭菌C.thermocellum27405在纤维二糖或纤维素两种不同基质中生长的细胞胞内蛋白和细胞膜蛋白质组研究发现，纤维素基质中生长的细胞能够提高其体内磷酸化羧激酶的含量，同时降低丙酮酸激酶和草酰乙酸脱羧酶的含量，其胞内ATP、NADPH的含量以及细胞膜的转氨作用都明显上调，在此基础上可以提高乙醇的产量[30]。发酵过程中产物乙醇浓度累积>1%(w/v)时会对细胞生长和终产物产生抑制作用，用MADLI-TOF-MS技术对比分析野生型和乙醇适应型菌株细胞膜蛋白质组显示，乙醇适应型菌株的细胞膜蛋白质组中超过70%的差异蛋白质含量出现下调现象，这些膜蛋白主要参与膜转运和新陈代谢作用；1/3参与信号传导和趋向性相关的蛋白质含量出现上调[31]。这一结果表明细胞膜蛋白质组分对乙醇胁迫环境能够做出及时调整。

3.3 产丙二醇梭菌细胞内纤维小体蛋白质组学研究

梭菌属中还存在可以进行发酵产1, 3-丙二醇的菌种，对此类工业发酵用菌种蛋白质组学研究也受到相应的关注。哥伦比亚学者González等[32]分离获得一株可以产1, 3-丙二醇的Clostridiumsp. IBUN 158B，并利用MALDI-TOF-MS技术研究了该菌在发酵过程中延迟末期(12 h)和指数生长末期(23 h)胞内蛋白质表达的差异性。质谱分析发现细胞延迟期末期所表达的蛋白质主要涉及ATP和NADH合成、细胞生长、利用培养基中营养物以及基本代谢中间物生成所需的酶(磷酸甘油激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、脱氧核糖磷酸醛缩酶、转酮醇酶等)，这些酶在梭菌属新种里未曾报道过。而从指数生长期末期分离的蛋白质进行质谱分析发现存在4种与1, 3-丙二醇代谢相关的关键酶(还原途径中的1, 3-丙二醇脱氢酶，氧化途径中的3-羟基丁酰辅酶A、NADPH-依赖型丁醇脱氢酶、磷酸丁酰转移酶等)。这些酶的发现有助于构建1, 3-丙二醇高产并且遗传性状稳定的突变菌株，提高1, 3-丙二醇的产量。

4 展望

随着蛋白质组学研究技术的不断成熟，蛋白质组学在研究细菌代谢机制、产物生成机理等方面都得到了广泛地应用，特别是对工业发酵菌种蛋白质组的研究正进入快速发展阶段。下一步对工业发酵菌种的研究方向之一是研究菌种发酵过程中，对环境改变而采取应激反应的时候关键蛋白酶的表达变化。例如在厌氧环境和微氧环境中，梭菌属细菌蛋白质表达差异，研究起到关键性作用的蛋白酶，期望实现厌氧菌在微氧环境中发酵降低发酵成本。蛋白质组学技术不断深入发展，蛋白质组学研究在提示诸如生长、发育和代谢调控等生命活动的规律上将会有所突破，对改造工业发酵菌种、降低发酵成本、缩短发酵周期、提高发酵产物产量将提供重要的理论参考。

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