唐耿铁， 王 平， 洪言情， 辛淑丽， 王 强， 范雪荣

(江南大学 生态纺织教育部重点实验室，江苏 无锡 214122)

丝素蛋白具有良好的物理机械性能、生物相容性及可降解性，以丝素蛋白为原料可制备生物医学和食品等领域中需要的凝胶、丝素膜及微胶囊材料[1-3]。为提高丝素蛋白材料的应用性能，不同的丝素蛋白改性方法得到应用：包括对侧链进行化学修饰，与其他高分子共混，或通过分子工程改性加工等[4-6]。而生物酶法具有高效、专一和生态环保的优势，并在高分子材料加工中得到广泛应用。丝素蛋白中含有约10%的酪氨酸残基[7]，可被多酚氧化酶(如酪氨酸酶)催化氧化，形成多巴及反应性强的多巴醌结构衍生物[8]，继而可与含氨基的化合物发生亲核反应，这为基于酶法的丝素蛋白改性提供了可能。本文以酪氨酸酶进行了丝素蛋白催化氧化，考察了酶促反应过程中丝素氧化产物(多巴及醌类衍生物)浓度的变化，对酶促氧化反应机制进行了探究，为丝素蛋白材料生物酶法功能改性奠定了研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

桑蚕丝织物，90 g/m2；酪氨酸酶(845 U/mg，美国Worthington Biochemical Corporation)；无水氯化钙，无水乙醇，乙二胺，N-N二甲基甲酰胺(DMF)等(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；乙二胺盐酸盐，3-甲基-2苯并噻唑酮腙盐酸盐(MBTH)，阿拉丁试剂(上海)有限公司。

UV-1800紫外可见分光光度计(SHIMADZU，日本)，F-4600荧光光度计(HITACHI，日本)，KDⅡ-0.05微机控制万能强力试验机(深圳市凯强利试验仪器有限公司)，D8 Advance型X-射线衍射仪(Bruker AXS，德国)，SU1510扫描电子显微镜(HITACHI，日本)。

1.2 实验方法

1.2.1 丝素蛋白溶液制备

将脱胶的桑蚕丝织物以氯化钙-乙醇体系(摩尔比CaCl2∶CH3CH2OH∶H2O =1∶2∶8)溶解，经100℃处理2 h后冷却至室温，以去离子水透析3 d，经离心去除杂质后得到丝素蛋白溶液，以称重法标定其浓度。

1.2.2 酪氨酸酶催化氧化丝素蛋白反应

在开放体系中用酪氨酸酶催化氧化1%(w/v)丝素蛋白溶液，处理条件：酪氨酸酶17 U/mL、30℃、pH值7.0，处理时间8 h，空白样中添加经失活处理的酪氨酸值酶。

1.2.3 丝素蛋白膜制备

在1.2.2条件下用酪氨酸酶处理丝素蛋白溶液(4% ，w/v)，空白样为同浓度的纯丝素蛋白溶液。将2种溶液在聚四氟乙烯模具中流延成膜，在室温下风干成膜，或先经-20℃冷冻5 h，再在-50℃下真空干燥24 h后得到冷冻干燥膜。

1.3 测试与表征

1.3.1 丝素溶液紫外分光分析

用UV-1800紫外可见分光光度计测定经酪氨酸酶催化的丝素蛋白溶液及空白溶液在300 nm～500 nm范围吸光度的变化。

1.3.2 丝素中多巴及多巴醌类氧化产物分析

多巴能与乙二胺盐酸盐反应生成具有荧光性质的缩合物，通过测定缩合物的荧光强度变化间接表征多巴的浓度变化。取20 μL的酪氨酸酶催化的丝素蛋白溶液，向其中加入70 μL乙二胺、50 μL乙二胺盐酸盐溶液(2 M，pH值11)和980 μL去离子水，50℃避光反应2 h，自然冷却后用F-4600荧光光度计扫描荧光强度，激发波长和发射波长分别为420 nm和543 nm[9]。

多巴醌类物质能与MBTH反应形成粉色染料，实验中取480 μL酪氨酸酶催化的丝素蛋白溶液，980 μL DMF水溶液(4.3%，v/v)，580 μL MBTH溶液(20.7 mM)，混合均匀后在25℃反应10 min，测定混合液在505 nm的吸光度[9]。

1.3.3 丝素蛋白游离氨基浓度

将1 mL酪氨酸酶处理后的丝素溶液加入含2 mL的0.5%(w/v)的茚三酮溶液比色管中，沸水煮20 min后冷却15 min，再加入5 mL含0.2%(w/v) KIO3的乙醇稀释液，混匀后用UV-1800测定569 nm处吸光度[5]。参照以不同浓度甘氨酸与茚三酮溶液制作的标准曲线(y=1.7698x-0.0013，其中y为569 nm吸光度；x为甘氨酸浓度，单位为μmol/mL)，计算出酶促反应前后丝素蛋白溶液中的氨基浓度变化。

1.3.4 强力测试

将丝素蛋白风干膜剪成70 mm×5 mm的长条，使用万能强力试验机测定丝素膜的应力-应变曲线，计算断裂强度、断裂伸长率，实验中拉伸速度20 mm/min，有效夹持长度40 mm。

1.3.5 XRD

用D8 Advance型X-射线衍射仪对丝素蛋白冷冻干燥膜进行X射线扫描，记录2θ=4°～40°间的衍射强度曲线。测试条件：铜靶CuKα(λ=0.15406 nm)、管电压40 kV、管电流40 mA、扫描速度为4°/min。

1.3.6 SEM

对冷冻干燥的丝素膜进行喷金处理，应用SU1510扫描电子显微镜观察丝素膜的多孔形态结构。

2 结果与讨论

2.1 丝素蛋白中酪氨酸残基酶催化氧化产物分析

图1 酪氨酸酶催化氧化丝素蛋白紫外可见光谱

以酪氨酸酶催化氧化丝素蛋白溶液，考察300～500 nm范围内溶液吸光度的变化，结果见图1。与酪氨酸酶溶液、丝素溶液及含失活酶的丝素溶液相比，图1中酶促氧化后丝素蛋白溶液在350 nm附近有明显的吸收峰，其原因可能与酪氨酸酶催化氧化丝素中酪氨酸残基形成醌类物质相关[10]。酪氨酸酶能将丝素蛋白中的酪氨酸残基(a)氧化成多巴(b)，然后多巴在酶催化下继续转化为多巴醌(c)，并与蛋白分子中氨基发生非酶参与的反应，生成不同产物(d、e或f)，见图2[8-9]。为研究酪氨酸酶催化氧化丝素蛋白的反应机制，实验中考察了酶催化反应时间与丝素溶液体系中多巴、多巴醌衍生物氧化产物含量的变化。

图2 酪氨酸酶催化氧化丝素蛋白机理[8-9]

(a)酪氨酸酶催化丝素

(b) L-酪氨酸

如图3(a)所示，丝素溶液中多巴含量总体上呈先增加，后下降的趋势。酶催化氧化丝素中的酪氨酸残基成多巴，使体系中多巴含量增加，同时多巴转化成醌类衍生物又使体系中多巴浓度下降。当酶处理时间超过120 min后，体系中多巴产物的新增速率下降，更多多巴转化成醌类衍生物；随着反应时间延长，图2中第3步非酶反应产物的浓度增加，其中具有醌类结构的产物d使得多巴醌衍生物表观含量增大，具有类多巴结构的还原产物二酚化合物f使体系中测得的多巴表观浓度略有增加。图3(b)采用L-酪氨酸为模型物，对上述酶促丝素蛋白氧化及交联机制进行了对照分析，多巴浓度亦呈先增加后减小再增加的趋势，多巴醌衍生物浓度达到峰值后持续下降，其原因可能是多巴醌在系列非酶反应中被还原成类多巴二酚结构(如5,6-二羟基吲哚)[11]。

2.2 酪氨酸酶催化氧化对丝素蛋白中游离氨基数的影响

丝素蛋白在酪氨酸酶催化氧化过程中生成的多巴醌能与氨基、巯基等亲核性基团发生非酶促反应，促进丝素蛋白分子自交联[7]。丝素蛋白含一定量的氨基，通过测定酶催化体系中剩余氨基含量变化，可从一定程度上评价酶催化反应中丝素蛋白分子自交联情况。图4考察了不同酶处理时间对体系中游离氨基含量的影响，结果表明随着处理时间延长，丝素蛋白溶液中游离氨基数逐渐减少，并且在480 min后渐趋缓和，表明在非酶反应中生成的多巴醌与丝素上伯胺基发生反应，促进了丝素蛋白分子间的交联。

图4 酪氨酸酶催化氧化丝素蛋白体系中氨基含量变化

图5 酪氨酸酶处理对丝素风干膜断裂强度及断裂伸长率影响

2.3 酪氨酸酶催化氧化对丝素蛋白膜强力的影响

将酶催化的丝素蛋白溶液铸膜并室温风干，通过强力测试分析酪氨酸酶催化对丝素蛋白室温风干膜机械性能的影响，结果见图5。与未经酪氨酸酶处理的空白样相比，经酪氨酸酶处理后丝素膜断裂强度增加，断裂伸长率下降较明显，表明酪氨酸酶处理促进了丝素蛋白分子间的交联，提高了膜材料的力学性能。

2.4 XRD

为考察酪氨酸酶催化氧化对丝素蛋白分子二级结构的影响，实验中以酶处理后的丝素溶液制备冷冻干燥膜，并进行膜材料XRD测试，结果见图6。丝素蛋白在11.8°，22.0°处的衍射峰由ɑ-螺旋结构引起，在16.5°，20.2°，24.9°，30.90°，34.59°，40.97°和44.12°处的衍射峰由β-折叠结构(SilkⅡ)引起[12]。从图中可知，纯丝素蛋白膜(1)在2θ=10°～12°有较弱的衍射峰，在2θ=20°～27°有较宽而强的衍射峰，说明纯丝素蛋白的冷冻干燥膜中ɑ-螺旋结构和无规卷曲结构(SilkⅠ)、β-折叠结构(SilkⅡ)并存，SilkⅡ的产生可能是由于冷冻过程中冰晶的剪切力引起的[13-14]。经酪氨酸酶处理后制得的丝素蛋白膜在2θ=22°～24°有相对较窄的衍射峰，其二级结构更趋于SilkⅠ结构，说明酪氨酸酶的对丝素蛋白的催化氧化引起了丝素蛋白二级结构的变化。

图6 冷冻干燥丝素膜的XRD曲线

图7 冷冻干燥丝素膜的SEM图

2.5 SEM

图7显示了经过不同处理丝素溶液制成的冷冻干燥膜的SEM图。纯丝素蛋白膜和经酶促氧化反应制得的丝素膜都呈现了多孔的结构，但纯丝素蛋白的冷冻干燥膜的孔径大而不规则，而经酪氨酸酶处理的丝素蛋白冷冻干燥膜孔径较为规则，表明酪氨酸酶对丝素蛋白催化氧化可能影响其在冷冻干燥过程中的孔隙结构。

3 结论

酪氨酸酶能将丝素蛋白中酪氨酸残基先后氧化成多巴及多巴醌，反应中多巴含量总体呈先增大后减小的趋势，非酶反应中多巴醌能与丝素蛋白中伯胺基反应，使体系中醌类衍生物表观含量明显增加，类多巴二酚结构产物略有增多。

丝素蛋白上的氨基与多巴醌的反应促进了丝素蛋白的自交联，表现为丝素蛋白经酪氨酸酶处理后，溶液中游离氨基数下降，制得的丝素室温风干膜的断裂强度增加，断裂伸长率下降。

以酪氨酸酶催化氧化丝素蛋白，制得的冷冻干燥膜中蛋白二级结构以SilkⅠ为主，膜多孔形态结构可能受酶催化氧化影响。

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