周璟明 陈宏 张祝兰 孙菲 张引 周剑 方东升

（福建省微生物研究所，福州 350007）

费氏链霉菌（Streptomyces fradiae）FIM-S38胞外产新霉素的发酵条件优化

周璟明 陈宏 张祝兰 孙菲 张引 周剑 方东升

（福建省微生物研究所，福州 350007）

旨在对Streptomyces fradiae FIM-S38胞外产生的次级代谢产物新霉素进行发酵条件优化。采用单因素筛选结合正交试验优化发酵培养基，探讨摇瓶发酵的主要影响因子初始pH值、装液量、转速等发酵参数的影响，确定了适宜发酵培养基组成和较佳发酵参数：葡萄糖6.0%，可溶性淀粉3.5%，黄豆粉2.0%，硫酸镁0.1%，碳酸钙0.3%，初始pH7.0，装液量50 mL/500 mL，摇床转速250 r/min，发酵温度35℃，发酵时间6 d，优化后的发酵水平较原生产工艺提高了50%以上。

费氏链霉菌 新霉素 正交设计法 发酵 优化

新霉素（Neomycin）系由费氏链霉菌（Streptomyces fradiae）［1］产生的氨基糖苷类抗生素［2，3］，是一种理想的干扰蛋白质合成的杀菌剂［4］，临床上主要用于治疗胃肠道和呼吸道感染，同时新霉素能提高饲料的利用率，促进禽畜生长，因此被广泛地应用于畜牧业，生产绿色食品［5，6］，近年来市场对新霉素的需求急剧增长。一些研究发现，新霉素能通过阻遏成纤维生长因子和内皮生长因子来干扰血管的形成，可能发展成为抗癌药物［7］，此外，还有研究发现新霉素具有巨大的抗HIV潜力［8］。目前国内新霉素生产中普遍存在发酵过程复杂、周期长，发酵水平波动性大，低产率高单耗等严重缺陷，优良新霉素菌种的发酵工艺优化已成为提高新霉素产量和质量的关键途径。本课题组前期对新霉素生产菌种Streptomyces fradiae SF1109进行抗性筛选获得一株新霉素的抗性基因突变高产菌Streptomyces fradiae FIM-S38，本研究拟对FIM-S38的发酵培养基组成及发酵参数进行优化，旨在为解决生产实际需要和提

高新霉素市场竞争力奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌 种 弗 氏 链 霉 菌Streptomyces fradiae FIM-S38，指示菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CPCC160020，由福建省微生物研究所提供。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 斜面培养基 参照马林等［9］报道的斜面培养基。

1.1.2.2 对照发酵培养基 参照滕慧等［10］报道的发酵培养基。

1.2 方法

1.2.1 培养方法 根据试验方案改变培养基组成及培养条件，采用划线法将培养好的菌种接入装有50 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，34℃、220 r/min培养168 h，测定发酵效价和菌体生长量。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 效价检测 参照《中国药典》2010 版抗生素微生物检定法（附录XI A），效价为3次平均值，以相对值标示。

1.2.2.2 菌体生长量测定 取10 mL发酵液于离心管中，3 500 r/min离心10 min，测得沉淀物在发酵液中的比例（Packed Mycelial Volume，PMV）即为菌丝浓度。

1.2.3 统计学分析 采用SPSS11.5软件进行统计分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 碳源的影响

以无碳源的对照发酵培养基，按3.0%的浓度分别添加糊精、可溶性淀粉、葡萄糖、甘油、麦芽糖等各种碳源发酵FIM-S38，以3.0%糊精为碳源的发酵培养基产新霉素的相对效价（Relative Titer，RT，%）为100，结果（表1）表明，碳源种类对新霉素产量的影响比对菌体生长大，FIM-S38菌浓度在13.5%-16.3%之间，可溶性淀粉和葡萄糖作为碳源时，产新霉素水平较高。因此选择可溶性淀粉和葡萄糖作为复合碳源。

表1 碳源对Streptomyces fradiae FIM-S38生长及合成新霉素的影响

2.2 氮源的影响

用无氮源的对照培养基，按3.0%的浓度分别添加蛋白胨、麸质粉、酵母粉、黄豆粉及玉米桨粉等各种氮源发酵FIM-S38，以3.0%蛋白胨为氮源的发酵培养基产新霉素的相对效价为100。结果（表2）表明，氮源种类对新霉素产量和菌体生长均影响明显，添加蛋白胨FIM-S38菌体PMV在13.5%，添加麸质粉、酵母粉、黄豆粉及玉米桨粉，FIM-S38菌体 PMV在21.6%-30.8%之间，其中黄豆粉作为氮源时，产新霉素水平最高。因此选用3.0%黄豆粉作为氮源。

表2 氮源对Streptomyces fradiae FIM-S38生长及合成新霉素的影响

2.3 无机盐的影响

在以3.0%黄豆粉为氮源的对照培养基中分别加入少量的无机盐进行单因子试验，以不加无机盐发酵产新霉素的RT为100，结果（表3）显示，培养基中添加微量金属离子对FIM-S38菌体生长影响较小，其PMV在20.0%-23.5%之间，铁、镁、钠、锌、钙盐对FIM-S38合成新霉素均具有促进作用，新霉素产量最高可达146.2。因此选择硫酸镁、碳酸钙为培养基中的无机盐。

2.4 培养基正交试验

根据上述试验结果，选择葡萄糖、可溶性淀粉、黄豆粉、硫酸镁和碳酸钙作为发酵培养基组成。正

交设计考察培养基各成分对产新霉素的影响，按表4所列因素和水平选用L16（45）表安排试验。结果（表5）显示，以对照发酵产新霉素的相对效价为100，通过正交设计助手软件分析，对产新霉素的影响主次顺序为葡萄糖＞可溶性淀粉＞黄豆粉＞碳酸钙＞硫酸镁，确定最佳组合为葡萄糖6.0%，可溶性淀粉3.5%，黄豆粉2.0%，硫酸镁0.1%，碳酸钙0.3%。

表3 无机盐对FIM-S38生长及合成新霉素的影响

表4 正交设计因素水平表

表5 正交试验结果

2.5 培养基初始pH值的影响

将优化发酵培养基调整至不同pH值进行发酵。以初始pH7.0的培养基发酵产新霉素的效价为100，结果（图1）表明，FIM-S38对酸碱性环境均有较强的适应能力，在初始pH3.0-11.0范围内菌体生长良好，酸性条件更利于菌体的繁殖，而在初始pH6.0-8.0范围内的发酵培养基最宜产新霉素，初始pH为7.0时新霉素产量最高。因此选择培养基的初始pH为7.0。

图1 初始pH值对FIM-S38生长及合成新霉素的影响

2.6 摇床转速的影响

在优化培养基中考察FIM-S38在不同转速下的发酵情况，以转速250 r/min发酵产新霉素的效价为100。结果（表6）表明，摇床转速在125-280 r/min之间时，随着转速的增加，其新霉素产量亦提高，因此考虑摇床实际情况250 r/min的转速较合适。

表6 摇床转速对FIM-S38合成新霉素的影响

2.7 培养基装液量的影响

对FIM-S38进行优化培养基的不同装液量发酵试验，以500 mL三角瓶装液量50 mL发酵产新霉素的效价为100。结果（表7）表明，发酵水平随装量的增多而降低，在一定的装量范围内通气量与发酵水平呈正相关，说明该菌株对氧的需求较高，而发酵液装量太少，蒸发量较大，发酵容积小，因此选择50 mL/500 mL三角瓶为适宜装液量。

表7 装液量对FIM-S38合成新霉素的影响

2.8 发酵温度的影响

在发酵培养过程中，菌体生长、代谢、产素的酶活性受许多因素影响，其中培养温度是一个重要影响因素。微生物有其最适和最耐受的温度范围，同一种微生物在不同的生长阶段和不同的生理、生化过程中，最适温度往往也不一样。由表8可知，在上述确定的发酵条件下，以35℃发酵产新霉素的效价为100，在28-35℃时产量与温度呈正相关，温度为35℃ 时发酵产量最高，温度提高到37℃时产量反而减少。因此在摇瓶培养过程中，35℃为菌体代谢最宜温度。

表8 发酵温度对FIM-S38合成新霉素的影响

2.9 菌体生长及生物合成新霉素的时间进程

FIM-S38在上述确定的发酵条件下的发酵时间曲线（图2）表明，在培养初期菌体大量生长而合成新霉素量少，在发酵48-72 h之后菌丝的生长发育即停止，但新霉素生物合成明显增加，以120 h发酵产新霉素的效价为100，在144 h其效价达到最高峰，其发酵效价为136.4。

图2 菌体生长及合成新霉素时间曲线

2.10 优化发酵条件的验证

在原发酵条件和优化发酵条件下进行5批次的发酵验证。以对照原发酵条件发酵产新霉素的RT为100，结果（表9）表明，优化组发酵液中的发酵水平较对照组提高了57%、菌体生长量降低了8%，因此进一步验证了Streptomyces fradiae FIM-S38的优化发酵参数。

表9 验证试验的结果（n=5）

3 讨论

改良微生物发酵参数，创造适合菌体生长和生物代谢的最佳条件，才能最大限度地发挥菌株的优良性能提高产物产量，因此探索菌株高产特性充分表达的最佳培养条件是发酵生产的基础与关键。由于Streptomyces fradiae FIM-S38系胞外产新霉素，在相同发酵水平下，发酵结束时菌体浓度越低越有利于发酵液过滤和提取等后期处理，即菌体浓度低而发酵效价高的发酵条件是理想的选择。因此采用正交设计法以发酵效价和菌体生长量为指标对新霉素的发酵培养基配方中各组分的含量进行优化，筛选获得了适宜发酵培养基组成和较佳发酵参数，其菌体生长良好而菌浓度明显减少，同时新霉素产量显著提高。通过在综合最优条件下的5批摇瓶发酵验证试验，证实优化发酵条件下FIM-S38的发酵水平明显优于对照，其发酵液中新霉素产量显著提高。

新霉素原发酵培养基组成成分多，培养液中存在大量不溶性颗粒，配制过程复杂，致使生产易染菌，成本高。在优化发酵培养基配方中，以单一氮源代替原生产工艺培养基中的多种氮源，配制简便，同时添加少量的镁、钙盐提高了菌体的代谢能力和目标产物的合成能力，通过条件优化发酵周期由原工艺的168 h 缩短到144 h，提高了产素率，若应用到几十吨乃至上百吨生产发酵罐进行工业生产，将会大大降低生产成本，增加产量，具有较强的市场竞争力。通过对弗氏链霉菌Streptomyces fradiae FIM-S38发酵过程控制研究，发现该菌株对氧的需求量较大，在生产工艺方面还有进一步改进提高的潜力，如生长因子、表面活性剂及其添加时间对生物合成目标产物的影响等，均有待深入的研究。

4 结论

通过对Streptomyces fradiae FIM-S38胞外产生的次级代谢产物新霉素进行发酵条件研究，采用单因素筛选结合正交试验优化发酵培养基组成，同时单因素试验考察摇瓶发酵参数，如初始pH值、装液量、转速等主要影响因子的影响，确定了适宜发酵培养基组成和较佳发酵参数：葡萄糖6.0%，可溶性淀粉3.5%，黄豆粉2.0%，硫酸镁0.1%，碳酸钙0.3%，初始pH7.0，装液量50 mL/500 mL，摇床转速250 r/min，发酵温度35℃，发酵时间6 d，优化后的发酵水平较原生产工艺提高了50%以上。

［1］Rinehart KL Jr, Stroshane RM. Biosynthesis of aminocyclitol antibiotics［J］. Journal of Antibiotics, 1976, 29（4）：319-353.

［2］Huang F, Spiteller D, Koorbanally NA, et al. Elaboration of neosamine rings in the biosynthesis of neomycin and butirosin［J］. Chembiochem, 2007, 8（3）：283-288.

［3］Waksman SA, Lechevalier HA. Neomin, a new antibiotic active streptomycin-resistant bacteria, including tuberculosis organisns［J］. Science, 1949, 109（3）：305-307.

［4］Mehta R, Champney WS. Neomycin and paromomycin inhibit 30S ribosomal subunit assemblyin Staphylococcus aureus［J］. Current Microbiology, 2003, 47（3）：237-243.

［5］沈川, 肖希龙.新霉素在动物体内的残留及其测定方法［J］.中国兽医杂志, 1998, 32（2）：253-256.

［6］管玉霞, 刘志琼.一种提高新霉素产素率新方法的初步研究［J］.产业与科技论坛, 2007, 6（7）：89-90.

［7］滕慧, 张亚雄.新霉素研究进展［J］.三峡大学学报：自然科学版, 2008, 30（2）：95-98.

［8］顾觉奋, 陈丽萍.新霉素A、B及其衍生物抗HIV作用的研究［J］.国外医药抗生素分册, 2008, 29（4）：154-159.

［9］马林, 达娃, 刘运, 等.费氏链霉菌中子辐射诱变菌株对新霉素的生物转化［J］.微生物学通报, 2010, 37（9）：1347-1355.

［10］滕慧, 张亚雄.复合诱变选育新霉素高产菌株的研究［J］.中国酿造, 2008, 13（7）：37-39.

（责任编辑 马鑫）

Optimization of Fermentation Conditions for Neomycin-producing Strain Streptomyces fradiae FIM-S38

Zhou Jingming Chen Hong Zhang Zhulan Sun Fei Zhang Yin Zhou Jian Fang Dongsheng
（Fujian Institute of Microbiology，Fuzhou 350007）

It was to optimize the fermentation conditions of neomycin producing by Streptomyces fradiae FIM-S38. The single factor experiments and orthogonal experiments were adopted to optimize the fermentation medium and conditions of FIM-S38 in shake flasks. The constituents of medium, the filling volume of shaking flask, the rotation speed and the temperature were the major factors that affected the yield of neomycin. The composition of glucose 6.0%, soluble starch 3.5%, soybean meal 2.0%, MgSO40.1% and CaCO30.3% was selected to be the medium formula, and the optimal fermentation parameters were as follows：the filling volume 50 mL for a 500 mL shake flask, initial pH at 7.0, shaker’s rotating speed 250 r/min, temperature 35℃, fermentation time 6 d, and the titer of neomycin was 50% higher than that in control.

Streptomyces fradiae Neomycin Orthogonal experiment Fermentation Optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.015

2014-05-28

福建省自然科学基金项目（2012J01094）

周璟明，女，硕士，助理研究员，研究方向：微生物药物；E-mail：15752437@qq.com

张祝兰，研究员，研究方向：微生物药物；E-mail：jessylan9963@sina.com