唐静静，何润霞，王 鲁

（1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 贵州省生化工程中心，贵州 贵阳 550025）

奶牛乳房炎是由各种病因引起的乳房炎症，给奶牛业造成巨大的经济损失。我们前期试验中报道了中药复方透皮剂在奶牛隐性乳房炎的治疗效果[1]，本复方是由金银花、连翘、蒲公英、大黄、当归等中药组成的中药制剂,具有清热解毒、消肿散结之功效。为了进一步研究其疗效，我们尝试将中药复方改变为注射剂用于乳区灌注进行临床实验，并进行热源检查及急性毒性试验，采用高效液相色谱(HPLC)和紫外分光法检测绿原酸、多糖、大黄酸、大黄素的含量等，旨在评价其临床疗效及其质量控制建立有效方法。

1 材料与方法

1.1 仪器 高效液相色谱仪，Agilent 1100Series LC/MSDSL；UV-2000 紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；LDZX-50KB立式电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；RE-52 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

1.2 药材及试剂 金银花、蒲公英、连翘、瓜蒌、当归、大黄、黄芪、芙蓉花8 味中药。购自贵阳市同济堂药店；绿原酸、大黄酸，均购自中国药品生物制品检定所，含量为80%；大黄素购自武汉远城科技发展有限公司；葡萄糖、有机化学试剂均为国产分析纯或色谱纯试剂。

1.3 动物 昆明系清洁级小鼠，购自贵阳医学院实验动物中心[SCXK（黔）2002-0001]；新西兰大耳白家兔，购自解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所医学实验动物中心[SCXK (渝) 2007-0005]。

1.4 金英黄归液注射的制备[2]将8味中药按比例混合，共500g，用50%乙醇浸泡30 min（料液比10∶1），回流提取2 h，多层纱布过滤。药渣再加50%乙醇（料液比8∶1），回流提取1 h，多层纱布过滤，合并滤液，旋转蒸发至无醇味，加入石油醚萃取，水相浓缩至2 g/mL，加乙醇，将溶液依次调整为70%、75%、80%乙醇溶液，每次4 ℃醇沉24 h，取上清进行50 ℃旋转蒸发，回收乙醇，将无醇的浓缩液加入注射用水，制备成1 g/mL的溶液，为澄明透亮的淡黄色液体状，加0.5%活性炭，煮沸，搅拌15 min，过滤到热源处理后的量筒中，制备成1 g/mL 的注射液，调pH 值为7.2，然后过0.22 μm滤膜除菌。在常温保存，1月后检查是否有可见沉淀物，检测其pH 值。

1.5 急性毒性试验[3]取体重20±2 g 健康小鼠50只，随机分成5 组，雌雄各半。4 个试验组分别灌胃0.625、1.25、2.5、5.0 g/kg 中药，空白组灌胃生理盐水，剂量0.5 mL/只，给药1 次，常规饲养14 d。观察小鼠的临床表现和死亡情况，以死亡为主要观察指标。

1.6 热原检查 参考文献[4]方法，取健康的新西兰大耳兔3 只，体重2.56～3.00 kg，雄性，注入给药前，每隔1 h 测量体温1 次，共测4 次，4 次体温在38.7 ℃～39.1 ℃范围内，符合供热原试验用，第三天，在测定其正常体温后15 min 内，自耳静脉缓缓注入20 mL 注射液，并温热至38 ℃。然后每隔1 h测量体温1 次，共3 次。

1.7 有效成分检测

1.7.1 中药复方中多糖含量的测定 参考文献[5]，黄芪多糖的含量检测采用超声提取和苯酚-浓硫酸比色法对黄芪多糖进行含量测定，先精确称取105 ℃干燥恒重的葡萄糖标准品100 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。依次稀释成0.008 mg/mL，0.016 mg/mL，0.024 mg/mL，0.032 mg/mL，0.040 mg/mL，0.048 mg/mL，0.056 mg/mL（即依次吸取0.4 mL，0.8 mL，1.2 mL，1.6 mL，2.0 mL，2.4 mL，2.8mL分别置于容量瓶50 mL规格中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀）。依次精密吸取1.0 mL各浓度的溶液加入10 mL试管中，空白孔加入蒸馏水，迅速加入5 mL浓硫酸和2%苯酚溶液0.15 mL，振荡5 min，置于沸水浴上加热15 min，用水稀释至刻度，然后置于冷水浴中冷却30 min，摇匀。以空白为参比，紫外分光光度计在490 nm 波长处，测定其吸光度值（OD490值），重复三次，取平均值。以标准品浓度（mg/mL）为横坐标，以其吸光度值（OD490值）为纵坐标绘制标准曲线。

本方法以无水葡萄糖标准品作标准曲线，为了除去单糖的影响，或检测注射液中是否含有单糖。经斐林试剂鉴定呈阴性，说明单糖在提取过程中已被除去。将样品溶液的原复方用蒸馏水稀释成4 倍，参照标品的处理方法进行测定。

1.7.2 中药复方中绿原酸含量的测定 参考文献[6-7]方法，精密称取绿原酸标准品（98%）5.08 mg 置于50 mL 的棕色量瓶中，加甲醇约30 mL，超声15 min，冷却加甲醇稀释至刻度，吸取标样1 mL 置于10 mL棕色瓶中，加甲醇至刻度即可，过0.45 μm的有机滤膜即可。另外精密量取25 mL 注射用药液于50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声15 min，用甲醇稀释至刻度，过0.45 μm的有机滤膜，将色谱纯甲醇其稀释10倍即可。将制备好的样品注入高效液相色谱仪，其检测条件：C18柱，流动相为乙腈:0.4%磷酸（10∶90），327 nm检测波长，30 ℃柱温。测量绿原酸标准品的峰面积（A标）、样品的峰面积（A样），根据公式计算待测样品中绿原酸的含量：mg/mL=C标×A样/A标。

1.7.3 中药复方中大黄酸、大黄素含量的测定参考文献[8]方法，精密称取大黄酸标品（98%）1.75 mg，置于50 mL 量瓶中，加入50%甲醇超声15 min，再加50%甲醇稀释至刻度，定容，过0.45 μm的有机滤膜即可。取大黄素（80%）2.5 mg 溶于甲醇50 mL，超声15 min。定容过滤即可。另精密量取5 mL 注射液，用氯仿萃取5 次，每次10 mL，合并氯仿液，水浴上蒸干，残渣加50%甲醇溶解，超声20 min，用50%甲醇稀释定容至50 mL，液体过0.45 μm 有机滤膜即可。将制备好的样品注入高效液相色谱仪。其检测条件：C18 柱，流动相为甲醇:0.1%磷酸（78∶22），流速0.8 mL/min，检测波长254 nm，柱温30 ℃。测量大黄酸、大黄素标准品的峰面积（A标）、样品的峰面积（A样），根据公式计算待测样品中大黄酸、大黄素的各自的含量：mg/mL=C标×A样/A标。

1.8 乳区注射用药对奶牛乳房炎的治疗效果观察

1.8.1 隐性奶牛乳房炎治疗 随机选取胎次、年龄、泌乳月相近，身体状况良好、乳房无临床异常、乳汁无肉眼可见变化的CMT 检测阴性的健康奶牛9 头（36 个乳区）为阴性对照组，CMT 检测阳性（患有隐性乳房炎）的奶牛6 头（7 个乳区），随机分成2组，阳性对照组6 头（阳性乳区7 个）和中药治疗组7 头（阳性乳区13 个）。治疗组奶牛早、晚挤完奶后，用温水清洗患牛乳区，干毛巾擦干，经乳导管每个乳区注入中药20～50 mL，每天2 次，连续用药3 d，第5 天奶牛乳区严格消毒，先弃去头3 把奶，采取乳汁按CMT 法检测乳汁，评价治疗效果。

1.8.2 临床型奶牛乳房炎治疗 对临床上发生奶牛乳房炎的病牛进行临床诊断及CMT 诊断，确定为临床型乳房炎的奶牛7 头用中药进行治疗，奶牛早、晚挤完奶后，用温水清洗患牛乳区，干毛巾擦干，酒精消毒，每个乳区注入中药注射用药20～50 mL，每天2 次，连续用药3 d，第5 天奶牛乳区进行临床诊断结合CMT 法检测乳汁，评价治疗效果。

2 结果

2.1 急性毒性试验结果 试验用小鼠无1 只死亡，LD50＞5 g/kg 体重，说明该药物毒性小。

2.2 热原检查结果 结果表示，3 只家兔的体温升高值均低于0.6 ℃，且体温升高总数低于1.4 ℃，认为该药热原检查合格[9]，结果见表1。

表1 注射用药家兔热原试验

2.3 金英黄归注射液中多糖的含量 以标准品浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度值（OD值）为纵坐标，求得标准曲线方程为y=14.594x-0.038（见图1）。根据标准曲线方程，计算出注射液（生药浓度1 g/mL）中多糖浓度为0.48×10-1mg/mL。

图1 U V测得糖标准曲线

2.4 金英黄归注射液中绿原酸的含量 绿原酸标准品HPLC图结果显示（见图2），绿原酸的出峰时间：5.96 min，其面积为2 803，待检样品在5.99 min时有出峰，其面积为8 363.9（见图3），根据公式计算，结果注射液中绿原酸的含量为0.59 mg/mL。

图2 绿原酸标准品H PLC

图3 样品H PLC

图4 大黄酸标准品H PLC

图5 大黄素标准品H PLC

2.5 金英黄归注射液中大黄酸、大黄素的含量 标准品HPLC图结果显示（图4、5），大黄酸4.62 min，大黄素7.57 min，其面积分别为1 210.5、1 617.1，待测样品其在4.61 min 时有出峰，其面积为9.3，在7.56 min时有出峰，其面积为67.5（见图6），根据公式计算，结果注射液中大黄酸的含量为0.26×10-2mg/mL，大黄素的含量为0.17×10-1mg/mL。

图6 样品H PLC

2.6 乳区注射用药对奶牛乳房炎的治疗效果观察CMT检测结果显示，隐性乳房炎的奶牛通过3 d中药乳区注射用药治疗后治愈率达53.8%，有效率达92.3%；患隐性乳房炎奶牛乳区自愈率为0；健康奶牛乳区发病率为13.9%；治愈率、有效率经X2检验中药透皮剂治疗组与阳性对照组比较差异显著或极显著（P＜0.05，P＜0.01），结果见表2。临床型乳房炎的奶牛通过3d中药乳区注射用药治疗后临床诊断其治愈率达88.9%，有效率达88.9%；CMT 诊断治愈率达33.3%，有效率达88.9%（见表3）。

3 讨论

3.1 中药及其复方的药效作用其根本原因是其有效成分在发挥作用，制备中药及其复方后对其有效成分的检测显得尤为重要，但由于中药及其复方有效成分的多样性，不可能完整对其进行检测。本复方中选择了金银花、黄芪、大黄等作为主要药物，这些中药的有效成分如绿原酸[7]、多糖、大黄酸等应该成为本制剂质量控制的基础数据。检测结果显示，本复方的绿原酸、多糖、大黄素含量分别为0.59 mg/mL、0.48×10-1mg/mL、0.17×10-1mg/mL，说明绿原酸、多糖、大黄素在本复方中占有较大的含量，可以确定为本制剂的质量控制指标。而大黄酸的含量为0.26×10-2mg/mL，可以不考虑为本制剂质量检测的指标。

表2 乳区注射用药治疗奶牛隐性乳房炎疗效

表3 乳区注射用药治疗奶牛临床型乳房炎疗效

3.2 在常温下保存制备的复方制剂，1 月后检查无可见沉淀物，仍然为澄明透亮的淡黄色液体状，说明制备的注射剂较稳定，其pH 值为7.2，家兔热源检测说明该注射剂无热源，LD50＞5 g/kg，说明制剂毒性小[3]，这些数据说明该制剂在临床上使用是安全的。在确保使用安全情况下，我们选择了临床型和隐性型两种奶牛乳房炎进行了临床试验，结果显示，金英黄归注射液对临床型的乳房炎的治愈率和有效率分别为33.3%和88.9%，同时该注射液对隐性乳房炎的治愈率和有效率分别为38.5%和84.6%，表明该中药配方对奶牛的乳房炎具有一定的治疗效果，这为进一步推广应用打下了试验数据。

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