武果桃，姜俊兵，牛国庆，任 杰，孟冬霞，赵 娟，牛 琛

（1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西 太原030032；2.山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030800；3.太原市小店区畜禽繁育工作站，山西 太原030032；4.东北农业大学资源与环境学院，黑龙江哈尔滨150030）

随着全球气候温室效应的不断加剧及畜牧高度集约化生产的发展，热应激对肉鸡的危害日益严重。肉鸡生长快、体型大、皮厚、皮下及腹部脂肪多，对热应激的抵抗力差。热应激是造成肉鸡猝死症的主要原因之一，严重制约肉鸡养殖业的健康发展，给肉鸡生产造成了严重的经济损失。

热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是在高温和其他应激条件下动物体内合成的一系列具有内源性保护作用的蛋白质，又名热应激蛋白。HSP70 是HSPs 家族中最重要的一员，在结构上具有高度保守性。应激状态下HSP70 在细胞内迅速合成，抵抗应激造成的组织细胞损伤，提高机体的热耐受能力而起到保护机体的作用[1]，这种热耐受能力主要与HSP70 有关[2-3]，而且与HSP70 的表达水平呈正相关［4-5］，一些抗热应激中药可通过提高HSPs 的表达来改善机体抗应激的能力［5-6］。HSPs 在应激条件下参与细胞的抗损伤、修复和热耐受过程，保护细胞生命活动，国内关于环境和HSPs 基因表达的研究很少[7]。本试验结合国内外热应激对鸡损伤的研究进展，人工制造热应激病理模型，通过复方中药对热应激肉仔鸡HSP70 mRNA 表达的研究，从分子水平提高对热应激的防治效果，为中药调控热应激蛋白机理及热应激的综合防制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验药物 健康18 日龄AA 肉仔鸡120 只，购自山西省太原市小店区明生养殖场；试验用中药，购自太原市双鹤药业有限公司。药方由山西省农业科学院畜牧兽医研究所中兽医药研究室筛选研制，以刺五加、黄芪、元胡、党参、五味子、山楂、甘草等药物按一定比例组方。经水提浓缩、过滤成浸膏，然后加入糊精等载体混合、烘干、粉碎制成每克成药含0.5 g 原生药的中药冲剂，再辅以一定维生素C 和维生素E 即得。于阴凉干燥处保存待用。

1.2 主要试剂 总RNA 提取试剂TRIZol（Invitrogen公司）；普通PCR试剂（北京康为世纪生物科技有限公司）；SYBR Premix（TaKaRa）；DM 2 000（北京康为世纪生物科技有限公司），琼脂糖（Agarose），Tris（Sigma 公司）；其余异丙醇，氯仿，乙醇等均为新近购买的实验室常规国产分析纯试剂。

1.3 试验设计 将120 只18 日龄健康AA 肉仔鸡随机分为4 组，即复方中药组、维生素组、纯中药组和高温对照组，每组30 只鸡，每组设2 个重复，人工制造慢性热应激病理模型，进行中药防治肉鸡热应激试验。试验共进行18 d，预试期3 d、正式试验期15 d。预试期间按常规进行饲养管理和防疫，正式试验期各组基础日粮完全相同，自由饮水，复方中药组在饮水中按每天每只鸡0.2 g 剂量添加自制中药冲剂，维生素组按标准添加维生素，纯中药组只添加自制中药冲剂，每日给药一次，高温对照组不添加任何药物。热应激环境温度、湿度的调节见表1。温湿度调节由温湿度控制器控制。

表1 热应激模型建立的温度、湿度控制

1.4 组织处理 试验结束后每组随机选3 只鸡(共12 只) 迅速宰杀，取出肝脏并用生理盐水冲洗干净，装于冰冻管后立即放人液氮罐中冷冻。

1.5 组织总RNA 的提取 将采好的肝脏组织约0.5 g 从液氮中取出，放入已经灼烧好的研钵中，用液氮将组织研成粉末；将组织粉末放到有1 mL TRIZol 的1.5 mL 离心管中，剧烈混匀，静置5 min；加入200 μL 氯仿混匀，静置3 min，12 000 r/min（4 ℃）离心15 min；吸取400 μL 上清液加入等体积的异丙醇，室温静置10 min，12 000 r/min（4 ℃）离心10 min；取出，倒掉异丙醇，再加入1 mL 75%预冷的乙醇进行漂洗，7 500 r/min（4 ℃）离心5 min；倒掉乙醇，自然晾干，加入20 μL 的ddH2O（灭菌蒸馏水），充分混匀后，进行电泳检测。

1.6 组织总RNA 质量鉴定 取1μL 分装的RNA溶液，用核酸蛋白测定仪测定其浓度及A260、A260/280、A260/230 的值。然后用常规1.2%琼脂糖凝胶电泳，检测所提取RNA 的质量。

1.7 引物设计 根据美国国立生物技术信息中心（NCBI）公布的鸡HSP70 基因序列和GAPDH 序列，应用Premier3.0 软件设计引物，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。为了检测各RNA 样品完整性和反转录效率之间的差别，将待测样品中的管家基因β-actin 设为内参照。引物序列如下：

HSP70mRNA sense：5′-GCGTAACACCACCATT CCC-3′ 19

HSP70mRNA antisense：5′-CGTCCTTTGTCATA GCCCTCT-3′ 21

GAPDH sense：5′-TGAAAGTCGGAGTCAACGG AT-3′ 21

GAPDH tisense：5′-ACGCTCCTGGAAGATAGT GAT-3′ 21

1.8 Real-Time RT-PCR 反应体系建立 cDNA 链的合成：10 μL 反应体系中含5×Prime ScriptTMBuffer 2 μL，total RNA 不多于5 00 ng，DEPC 水加至10 μL。上述成分混匀后置于PCR 仪器中，反应条件为37 ℃15 min；85 ℃5 s。RT 产物保存于-20 ℃备用。

1.9 Real-time RT-PCR 扩增条件建立 （1）反应体系：每个RNA 样品分别使用目的基因和内参基因引物基因进行荧光定量PCR 反应。25 μL 反应体系如下：12.5μL SYBR®Premix，0.5 μL PCR Forward Primer（5 μmol/L），0.5 μL PCR Reverse Primer（5 μmol/L），1 μL cDNA 溶液，最后用ddH2O（灭菌蒸馏水）补充至25 μL；（2）反应条件：95 ℃预变性1 min 后，95 ℃10 s，61 ℃30 s，72 ℃30 s，72 ℃1 min；30 个循环。反应结束后，由熔解曲线判定PCR 反应的特异性，根据扩增动力学曲线的CT 值计算定量结果。内参基因β-actin 与目的基因在同一条件下不同管内扩增，每个样本设3 次重复，最后取平均值。

1.10 标准曲线的制备 取2 μL cDNA 样为模板，按2 倍浓度梯度稀释，进行荧光定量PCR 反应。反应结果用IQ-5（美国biorad）自带软件自动进行数据分析并绘制标准曲线，以确定目的基因和内参基因扩增效率。

1.11 PCR 产物鉴定 根据产物片段大小，采用1%琼脂糖凝胶电泳。5 μL 样品与1 μL 溴酚蓝混合后点样，同时点DNA Marker 5 μL；电压120 V 电泳20 min 后，紫外灯下观察，凝胶成像系统采集图像。运用DNA Marker 测算目的基因产物片段的大小。

2 结果

2.1 组织总RNA 的提取，提取效果如图1。

图1 总R NA 提取效果

提取的肝脏样品总RNA，经浓度和纯度检测，各样品的OD260/OD280比值均在1.8～2.0 之间，说明RNA 的纯度很好。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测发现，5 s、18 s 和28 s 带均很清晰完整，说明提取和纯化效果较好，RNA 未发生降解。可用于后续试验。

2.2 RT-PCR 扩增结果 HSP70 mRNA 和GAPDH的扩增片段长度分别为228 bp 和111 bp。反应体系加入相应引物后，PCR 扩增产物与引物设计应扩增的片段相符，经扩增效率分析显示，内参基因和HSP70 基因扩增效率均为95.5%；其相关系数R2 分别为0.999 和0.991；标准曲线斜率均为-3.435，可以应用Comparative Delta-delta Ct 法进行分析。

2.3 内参基因和HSP70 基因扩增动力学曲线分析及熔解曲线 见图2、图3。

图2 内参基因和H S P70基因扩增动力学曲线

图3 内参基因和H S P70基因熔解曲线

内参基因及HSP70 基因扩增动力学曲线符合标准的“S”型荧光增长曲线，并且平行性较好，基线平整拐点清晰，无明显上扬趋势。

2.4 扩增产物凝胶电泳分析 见图4。

图4 内参基因及H S P70扩增产物凝胶电泳

经熔解曲线和扩增产物凝胶电泳分析显示，内参基因和HSP70 基因扩增产物Tm 值均一；分别只有一个单独的峰。说明在实时定量过程中，荧光强度均来自于特异扩增产物，无引物二具体的产生，无非特异扩增。

2.5 热应激鸡肝脏组织中HSP70 实时定量PCR结果 见图5。

图5 H S P70实时定量PC R 结果

3 讨论

HSP70 基因没有内含子，这一特异性保证了它们一旦启动转录就可产生出成熟的mRNA 以适应HSP70 大量快速表达的需要，防止应激对其mRNA 前体的影响。Craig 等（1991）报道，高温可增强热应激转录因子的活性，加强HSP70 mRNA合成，从而增加HSP70 质量浓度。

研究表明，女贞子、五味子和四君子汤都能显著提高热应激蛋鸡肝脏HSP70 基因的表达，这几种药物的抗热应激作用与其调控HSP70 基因表达有关[8]。本试验中复方中药冲剂组及纯中药冲剂组肉鸡肝脏HSP70 基因表达量显著提高，分别比高温对照组、维生素组高2.98 倍、3.28 倍和4.66 倍、5.13 倍，说明本试验中药制剂可显著提高热应激肉鸡肝脏HSP70 mRNA 的表达，增强抗热应激能力。

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