付明哲，李长安，魏拣选，白 涛

（西北农林科技大学动物医院，陕西 杨凌712100）

隐性乳房炎主要由病原微生物感染奶牛乳腺所引发的一种炎症反应。该病临床症状不明显，但病牛产奶量下降，乳汁化学成分发生了变化。我国奶牛隐性乳腺炎的发病率为46.4%～85.7% ，经济损失较大[1]。许多奶牛场兽医缺乏病原学检查的条件，仅凭经验滥用抗生素治疗乳房炎，导致病菌产生耐药性。所以及时掌握该病致病菌的种类和耐药性情况是防治该病的关键。细菌编码自动检测技术是快速检测动物致病菌的一种新途径，和传统的病菌分离方法相比，具有快速、简便和准确的优势，耐药性分析功能较强，但在我国兽医临床应用中鲜有报道[2]。2009-2013年，笔者从陕西省部分奶牛场采集隐性乳房炎病牛的乳样，应用自动细菌鉴定及药敏测试仪对隐性乳房炎病原菌进行了分离和药物敏感试验，旨在为指导治疗隐性乳房炎合理用药提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 被检材料 乳样采至陕西省56 个奶牛场，无菌采集体细胞计数在80 万以上的阳性乳的乳样431 份，置4 ℃冰箱内保存不超过24 h。

1.2 培养基及主要试剂 普通琼脂、营养肉汤、麦康凯琼脂、鲜血琼脂平板培养基、细菌生化卡、药敏试验卡，均由杭州天和微生物试剂有限公司生产；隐性乳房炎CMT 诊断液，由美国Immucell公司生产。

1.3 仪器设备 TDR-200B 自动细菌鉴定及药敏测试仪（杭州天和微生物试剂有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 隐性乳房炎检测 CMT 法诊断为隐性乳房炎奶样，每份奶样取10 mL，3 000 r/min 离心5 min，弃去管中的上清液，取底部沉淀物备用。

1.4.2 自动生化鉴定 无菌吸取150 μL 沉淀物分别接种于培养基，37 ℃培养24 h，挑单个菌落革兰染色，镜检后按照仪器说明分类进行生化鉴定。将菌落接种于生化培养液，制成菌悬液，用浊度计调整至0.5～1.0 麦氏单位，菌悬液分别加在鉴定板的各孔中，每孔100 μL，盖上板盖，标菌株号，置培养箱内35 ℃培养16～24 h。取出鉴定板，置阅读器上自动检索数据库，记录鉴定结果。

1.4.3 自动药敏试验 筛选3 种主要的致病菌，调好药敏培养液，接种于药敏试验平板上，每孔150 μL，35 ℃培养18～24 h，仪器自动判断结果，依据微生物分析系统M100 S18 版的标准判定耐药菌，细菌耐药率：耐药率=耐药菌株数/分离菌株数×100%。

1.5 统计方法 卡方检验和t 检验。

2 结果

2.1 主要病原菌分离情况 在431 份奶样中，有411个检出细菌714 株，细菌检出率为95.36%。渭南市的85 份奶样中有82 个检出细菌170 株，检出率为96.47%；西安市的97 份奶样中有91 个检出细菌155株，检出率为93.81%；咸阳市的109 份奶样中有101个检出细菌204 株，检出率为92.66%；宝鸡市的140份奶样中有136 份检出细菌273 株，检出率为97.14%。隐性乳房炎乳样中分离到病原菌共17 种，其中主要致病菌为金黄色葡萄球菌（14.96%），无乳链球菌（15.64%），大肠杆菌（10.97%），乳房链球菌（6.23%），棒状杆菌（5.61%），沙门菌和克雷伯氏菌（均占5.24%），酵母（4.99%），橼酸杆菌（4.74%），坏死杆菌（4.49%），其他细菌的检出率与主要致病菌差异显著（P＜0.05）。乳样的细菌分离情况见表1。2.2 病原菌的混合感染情况 陕西省4 个主要养牛区奶牛隐性乳腺炎的主要致病菌为金黄色葡萄球菌，链球菌和大肠杆菌。病原菌单独感染率为5.15%～7.35%，由2 种细菌混合感染感染率为5.15%～11.30%，由3 种细菌混合感染感染率为38.97%～49.45%，结果见表2。

表1 致病菌自动分离结果

2.3 药敏试验 结果见表3。金黄色葡萄球菌对氨苄青霉素、环丙沙星、庆大霉素、复方新诺明、青霉素、诺氟沙星耐药率为66.67%～91.67%。无乳链球菌对氨苄青霉素、环丙沙星、青霉素、庆大霉素、复方新诺明、红霉素、链霉素耐药率为63.78%～75.60%。氨苄西林、复方新诺明、四环素、阿奇霉素、红霉素、林可霉素、诺氟沙星、青霉素、链霉素对大肠杆菌敏耐药率为48.86%～100%。

表2 主要病原菌感染情况

3 讨论

传统的微生物检测一般通过培养特性、菌落形态、染色特性、生化试验及动物致病性试验来确定病原菌，存在生化特性不稳定，操作繁琐，费时费力等缺点[3]。而TDR-200B 自动细菌鉴定及药敏测试仪通过检测细菌在培养基中不同代谢特征和生长情况，结合编码自动检测技术及回归统计，快速提供致病菌的生化鉴定和药敏试验结果[4]。在24 h 内将菌株准确鉴定到属水平和菌种水平[5]。这种方法为细菌鉴定自动化、快速化及简便化发展提供了条件[6]。陕西省奶牛场的隐性乳房炎主要病原菌共17种，分别为金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、乳房链球菌、棒状杆菌、沙门菌、克雷伯氏菌、酵母、橼酸杆菌和坏死杆菌。国内一些学者用传统细菌分离方法研究表明，隐性乳房炎的细菌检出率一般在80%以上[7]，本次细菌自动分离检出率为92.66%～97.14%。说明应用该仪器是一种微量、快速、敏感的鉴定致病菌方法。未检出细菌的乳样多因含有抗生素，部分是由支原体等其他病原引起的。

表3 主要致病菌的耐药率

渭南、西安、咸阳和宝鸡市隐性乳房炎感染的病原菌种类大体相似，但细菌感染的种类随着抗生素的广泛应用和卫生消毒措施的加强而发生动态变化，部分奶牛场隐性乳房炎已由链球菌、葡萄球菌转为支原体感染为主，有的牛场隐性奶牛乳房炎的细菌感染以葡萄球菌为主变化为大肠杆菌感染为主。发生2种或2种以上病原混合感染率为63.51～69.52%，表明隐性乳房炎混合感染占大多数。链球菌是隐性乳房炎感染中最主要的致病菌，以无乳链球菌，停乳链球菌，粪链球菌为主。这与国内有关报道基本类似[8]。无乳链球菌是导致乳腺慢性感染的专性寄生菌，与其他细菌共同感染可发生临床型乳腺炎[9]。金黄色葡萄球菌易引起乳房的肉芽肿与纤维变性，其致病力的强弱与毒力因子多样性密切相关[10]。链球菌和金黄色葡萄球菌主要通过挤乳工、挤乳机传播。

从目前的检测结果来看，单独环境性病原菌占到细菌总数的60%左右，检出率最高为大肠杆菌，这些病原菌的检出率有逐年增高的趋势。奶牛在应激因素的刺激下，引起机体抵抗力降低，这些细菌借助圈舍、粪便、垫草、污水、挤奶器及饲养员在奶牛群中传播和流行。因此，控制环境性病原菌的感染是防治隐性乳腺炎的关键措施，例如加强环境卫生和消毒措施，改善挤奶技术和设备，注意乳头消毒减少环境性病原菌的感染；定期添加补气健脾、活血化瘀的中草药添加剂，保证精料中维生素和微量元素的含量，以增强奶牛抗病能力，每年检测和治疗隐性乳腺炎减少传染源[11]。

由于奶牛乳腺特殊的生理结构和药动学机制，全身或乳房局部给药都很难使乳汁内抗生素达到有效浓度[12]。为了取得疗效，兽医通常选用高剂量的广谱抗生素或将几种抗生素联合在一起给药，尽管降低了感染率，但细菌对常用抗菌药产生了不同程度的耐药性[13]。因此，规模化养殖场应根据细菌分离鉴定及药物敏感试验结果合理选用抗菌药物，严格遵守抗生素的使用用量、休药期及药物最高残留量的规定，以延缓耐药菌产生；尽量使用最廉价和最窄谱的抗生素，或者轮换应用抗生素，才能有效的控制隐性乳房炎的流行和传播。

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