何敏，武志强，史玉荣，李翔，龚锡平，陈思敏，曾南

·药理毒理·

黄芪多糖对环丙沙星体内抗菌后效应的影响

何敏，武志强，史玉荣，李翔，龚锡平，陈思敏，曾南

目的：观察黄芪多糖预处理免疫抑制模型小鼠，对环丙沙星体内抗菌后效应（PAE）的影响作用。方法：采用二倍稀释法和菌落计数法，测定环丙沙星体外抗金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923的MIC、MBC值。黄芪多糖250 mg．kg-1连续灌胃小鼠1周，灌胃第3天和第6天小鼠分别腹腔注射150 mg．kg-1、100 mg．kg-1环磷酰胺制备免疫抑制模型；采用体外PAE诱导的方法制备含2MIC环丙沙星的菌液感染免疫抑制模型小鼠，观察黄芪多糖对环丙沙星体内PAE的影响，同时进行各组小鼠全血白细胞计数及胸腺与脾脏指数的测定。结果：环丙沙星体外对金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923的MIC、MBC分别为0.06～0.12 5 µg．mL-1、0.25～1µg．mL-1。模型组小鼠胸腺、脾脏指数及白细胞计数均较空白组显著降低（P＜0.01），表明免疫抑制模型成功。黄芪多糖与模型组比较，在感染后期对模型小鼠的胸腺、脾脏指数与白细胞计数有一定的改善作用；环丙沙星+黄芪多糖组与环丙沙星组比较，亦对上述指标有一定改善作用。黄芪多糖预处理对环丙沙星的体内PAE无明显延长效应。 结论：黄芪多糖对免疫抑制感染模型小鼠的非特异性免疫功能有一定提高作用，但对环丙沙星在模型动物体内的PAE无明显影响。

]黄芪多糖；环丙沙星；体内抗菌后效应

抗菌后效应（Post antibiotic effects， PAE）是指药物与细菌短暂接触后，当药物清除或低于最小抑菌浓度时细菌生长仍受到持续抑制的效应[1]。临床资料表明，某些具有抗菌作用的中药与抗菌药物联合使用可增强其抗菌作用[2]。依据目前对PAE机制认识的抗生素后促白细胞效应[3]，以及多数中药多糖成分具有提高机体免疫功能，升高白细胞数目的研究基础，本实验采用黄芪多糖预防给药，以金黄色葡萄球菌感染免疫抑制小鼠为模型，观察黄芪多糖对环丙沙星体内PAE的影响，拟从促白细胞效应角度为中药辅助抗菌药物抗感染治疗提供一定实验依据。

1 实验材料

1.1 材料

1.1.1 实验动物 KM小鼠，SPF级，体重18～22g，雌雄各半，四川省医学科学院实验动物研究所提供，合格证号：scxk（川）2008-24。

1.1.2 药物与试剂 环丙沙星，地奥集团成都药业股份有限公司，批号120101。 环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号12042125。黄芪多糖（纯度95%），陕西森弗生物技术有限公司，批号HQDT121203。M-H(A)培养基、M-H(B)培养基均由OXOID提供。

1.1.3 菌株 金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923，四川省抗菌素工业研究所惠赠。原始菌种于甘油中保存于－20℃冰箱。试验用菌制备：采用接种环取原始菌一环，涂布于M-H(A)平板复活后，选取长势良好的单一菌团接种于M-H(A)斜面，35℃隔夜孵育后，密封，4℃冷藏保存备用；实验前一天取斜面菌涂抹于M-H(A)平板，35℃孵育过夜复活，即可使用。

1.1.4 仪器与试剂 MEK-6318K全自动血细胞分析仪(日本光电仪器公司)；HZQ-C空气浴摇床(哈尔滨市东联电子技术开发公司)；BPH-9162电热恒温培养箱(上海一恒科技有限能公司)；电子天平(Sartorius公司)；麦氏比浊仪(法国 bio Merieuxsa)。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 环丙沙星体外抗菌活性测定 采用二倍稀释法和菌落计数法，测定环丙沙星对浊度为1×106CFU．mL-1的金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923的最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC），求得MBC/MIC值，试验重复3次。

2.1.2 体外PAE的诱导及药物的去除 PAE的诱导采用体外药物接触法[4]，用已灭菌的营养肉汤培养基将受试药物环丙沙星配成浓度为20 MIC的药液。取药液0.5 mL加入含4.0 mL营养肉汤的试管中，每管再加入0.5 mL浊度为1×108个/mL菌液，使混合液药物最终浓度为2 MIC，标为试验管（T），同时设对照管（C），由4.5 mL营养肉汤与0.5mL菌液混合。各管涡旋混匀后，37℃恒温培养1 h。采用800倍稀释除药法，即药物诱导1 h后，取T、C管中的菌液0.1 mL，分别加入含1.9 mL37℃预温的营养肉汤试管中，充分混匀后再吸取0.1 mL菌液，分别加入另外含3.9 mL37℃预温的营养肉汤的试管中，备用。

2.1.3 动物分组、给药及造模 健康KM小鼠，雌雄各半，按体重分层、性别随机分为空白组，感染模型组，环丙沙星（感染菌液含环丙沙星0.12 µg．mL-1）组，黄芪多糖（ig.250 mg．kg-1）组，黄芪多糖（ig.250 mg．kg-1）+环丙沙星（感染菌液含环丙沙星0.12 µg．mL-1）组。动物感染菌液前黄芪多糖组、黄芪多糖+环丙沙星组分别灌胃给予黄芪多糖，连续7天[5]，其余各组给予等体积蒸馏水。除空白组小鼠外，其余各组小鼠在灌胃第3天和第6天分别腹腔注射环磷酰胺150 mg．kg-1、100 mg．kg-1造成免疫抑制。

2.1.4 体内PAE的测定与计算[4]除空白组小鼠，其余各组小鼠股部肌肉注射实验“1.5.2”中经PAE诱导和药物去除后的菌液0.1 mL进行感染，其中环丙沙星、环丙沙星+黄芪多糖组注射T管菌液，模型组、黄芪多糖组注射C管菌液，此时计为动物感染后的零时，各组感染小鼠分别于动物感染后0、2、4、6、8、10 h处死5只，无菌剖取其股部针眼周围肌肉0.1 g，0℃无菌生理盐水制成10%的匀浆液，取稀释的匀浆液10µl（通过预试，确定感染0 h，2、4、6h，8、10 h样品的稀释倍数分别为0、10、100倍）接种平板进行菌落计数[6]，得出CFU．mL-1值。按公式PAE=T-C 计算。其中T为实验组（环丙沙星组、黄芪多糖组、环丙沙星+黄芪多糖组）细菌的CFU．mL-1高于感染后零时10倍所需要的时间；C为模型组细菌的CFU．mL-1高于感染后零时10倍所需要的时间。同时，各组小鼠处死前眼眶取血，进行白细胞计数；亦剖取小鼠胸腺与脾脏，计算胸腺、脾脏指数。空白组小鼠不感染菌液，仅同法操作取血进行白细胞计数、剖取胸腺与脾脏。试验重复1次。

2.2 结果

2.2.1 环丙沙星体外抗菌活性测定 实验测得环丙沙星体外抗金黄色葡萄球菌ATCC25923的MIC为0.06～0.125 µg．mL-1，MBC为0.25～1 µg．mL-1，MBC/MIC值为4，与文献报道基本一致[7]。

2.2.2 黄芪多糖对模型小鼠胸腺、脾脏指数的影响 见表1、表2。空白组与模型组比较，可见模型组小鼠胸腺、脾脏指数显著低于空白组（p＜0.01），提示环磷酰胺免疫抑制模型成功。黄芪多糖组与模型组比较，小鼠胸腺指数有一定的升高，脾脏指数变化不明显；黄芪多糖+环丙沙星组在感染8～10 h内，小鼠的胸腺、脾脏指数相比较于环丙沙星组有增高趋势。

表1 黄芪多糖对环磷酰胺造模小鼠胸腺指数的影响（±s，n=9）

表1 黄芪多糖对环磷酰胺造模小鼠胸腺指数的影响（±s，n=9）

注：与各时间点模型组比较，**p＜0.01

组 别 剂量 胸腺指数（g/g体重*100%）（mg．kg-1） 0 h 4 h 6 h 8 h 10 h空白组 --- 0.33±0.10**模型组 --- 0.12±0.04 0.075±0.020 0.074±0.036 0.087±0.022 0.082±0.037黄芪多糖 250 0.109±0.47 0.097±0.033 0.087±0.020 0.093±0.027 0.093±0.037环丙沙星 --- 0.093±0.024 0.10±0.023 0.11±0.050 0.097±0.023 0.098±0.065黄芪多糖+环丙沙星 250 0.094±0.042 0.091±0.033 0.10±0.043 0.14±0.096 0．14±0．051

表2 黄芪多糖对环磷酰胺造模小鼠脾脏指数的影响（±s，n=9）

表2 黄芪多糖对环磷酰胺造模小鼠脾脏指数的影响（±s，n=9）

注：与各时间点模型组比较，**p＜0.01

组 别 剂量 脾脏指数（g/g体重*100%）（mg．kg-1） 0 h 4 h 6 h 8 h 10 h空白组 --- 0.37±0.14**模型组 --- 0.17±0.055 0.13±0.028 0.14±0.068 0.16±0.036 0.17±0.040黄芪多糖 250 0.17±0.426 0.16±0.037 0.13±0.039 0.14±0.044 0.14±0.033环丙沙星 --- 0.12±0.232 0.14±0.017 0.16±0.022 0.14±0.024 0.15±0.033黄芪多糖+ 250 0.15±0.05 0.16±0.042 0.15±0.037 0.17±0.045 0.17±0.052环丙沙星

2.2.3 黄芪多糖对模型小鼠白细胞计数的影响 见表3、表4。空白组与模型组比较，其白细胞计数明显高于模型组（p＜0.01），提示免疫抑制模型成功。黄芪多糖组在感染4～10 h内，白细胞计数较模型组有增高的趋势；在整个感染过程中，环丙沙星组与黄芪多糖+环丙沙星组小鼠白细胞计数均呈现先升后降的趋势，且后者在感染10 h时高于前者。试验进行2次。

表3 黄芪多糖对环磷酰胺造模小鼠白细胞计数的影响(±s，n=5，第1次)

表3 黄芪多糖对环磷酰胺造模小鼠白细胞计数的影响(±s，n=5，第1次)

注：与各时间点模型组比较，**p＜0.01；*p＜0.05

组 别 剂量 全血白细胞计数（×109个/L）（mg．kg-1） 0 h 4 h 6 h 8 h 10 h空白组 --- 8.18±1.78**模型组 --- 1.3±0.5 0.98±0.66 0.90±0.12 0.78±0.18 0.54±0.25黄芪多糖 250 0.48±0.21 1.57±0.60 0.94±0.41 1.04±0.62 0.92±0.11*环丙沙星 --- 0．54±0．34 1.08±0.50 2.78±1.95 2.44±2.16 0.48±0.20黄芪多糖+环丙沙星 250 0.66±0.23 1.04±0.56 0.78±0.18 0.88±0.46 0.78±0.18

表4 黄芪多糖对模型小鼠白细胞计数的影响(±s，n=5，第2次)

表4 黄芪多糖对模型小鼠白细胞计数的影响(±s，n=5，第2次)

注：与各时间点模型组比较，**p＜0.01；*p＜0.05

组 别 剂量 全血白细胞计数（×109个/L）（mg．kg-1） 0 h 4 h 6 h 8 h 10 h空白组 --- 2.86±0.59**模型组 --- 1.56±0.91 0．84±0．73 0.76±0.53 0.65±0.31 0.44±0.22黄芪多糖 250 1.40±0.79 1.36±0.33 0.82±0.20 0.72±0.49 0.57±0.28环丙沙星 --- 0.76±0.25 0.96±0.29 0.90±0.22 0.52±0.29 0.72±0.31黄芪多糖+环丙沙星 250 1.05±0.76 1.3±0.67 0.60±0.36 0.85±0.33 0.87±0.41*

2.2.4 黄芪多糖对环丙沙星体内PAE的影响 见表5。两次实验分别测得环丙沙星体内PAE为2 h、1.24 h，黄芪多糖预处理对此无影响。环丙沙星两次实验获得的PAE不一致，主要与体内实验中感染的菌量不一致有关。

表5 黄芪多糖对环丙沙星体内PAE的影响（h，n=5）

3 讨论

中药黄芪具有补脾升阳，益肺固表，利尿消毒，托毒生肌等功效，主要含皂苷类、多糖类、黄酮类化合物，具有增强机体免疫功能、促进骨髓造血功能、抗溃疡、抗病原微生物等药理作用[8,9]。其中有效成分黄芪多糖[10]具有良好的免疫调节作用，表现为促进抗体生成，增强巨噬细胞吞噬细菌、病毒等微生物的能力，还能增强小鼠NK细胞活性，增强T、B淋巴细胞功能而提高机体抗菌、抗病毒作用；黄芪多糖亦能抑制内毒素（LPS）诱导的巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β及NO等炎性介质，从而减轻病毒及细菌对机体的炎症损伤[11]。目前，PAE已成为评价新的抗菌药物、设计合理给药方案的重要参考指标，现代研究也认为临床上中药与抗菌类化学药物联合应用[2]，可发挥一定的增效减毒作用。本实验基于黄芪多糖的研究基础，从PAE的抗生素后促白细胞效应机制出发，提出具有免疫增强作用的黄芪多糖能延长抗菌药物PAE的工作假设，采用体外PAE诱导、体内PAE测定方法观察黄芪多糖预处理对环丙沙星抗金黄色葡萄球菌PAE的影响作用，结果表明黄芪多糖对环丙沙星体内PAE并无明显影响；但从环磷酰胺免疫抑制模型动物的胸腺指数、脾脏指数及全血白细胞计数等指标结果可以发现，该模型的免疫抑制效应成功，黄芪多糖对此有一定提高趋势。

本次实验测定PAE选用的是体外PAE诱导（抗菌药物与细菌体外接触）的方法。该法操作简便，符合PAE理论，利于测定清除药物后细菌恢复对数生长的时间，然而该方法易致模型对照组与给药组的细菌感染力度出现差异，致使测得的PAE存在一定误差，且不能完全复制机体感染细菌、服药至药物消除这一过程，这可能是两次实验环丙沙星PAE不一致的原因。此外，实验所用的中性粒细胞减少小鼠免疫抑制模型，环磷酰胺腹腔注射给予小鼠后，小鼠体内白细胞计数急剧降低，黄芪多糖在短时间内对其并无明显的改善作用，推测是黄芪多糖对环丙沙星体内PAE影响不明显的原因之一。

基于黄芪多糖的抗菌抗病毒研究基础，虽然本次实验未发现其对环丙沙星抗金黄色葡萄球菌的体内PAE有明显影响，但仅提示黄芪多糖对此抗菌药物、对此菌种感染的影响，黄芪多糖与其他类抗菌药物联用是否能影响其体内PAE或与环丙沙星合用对其他感染菌（临床分离的致病菌）的影响有待进一步研究。此外，在今后的试验中可尝试采用药物与细菌在体内接触的方法，借助感染组织支架模型或兔脑膜炎模型等来测定黄芪多糖对抗菌药物体内PAE的影响。

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（责任编辑：陈思敏）

Effects of Astragalus Polysaccharides on PAE of ciprofoxacin in vivo/

HE Min, WU Zhi-qiang, SHI Yu-rong, LI Xiang, GONGXi-ping, CHEN Si-min, ZENG Nan//(Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China)

Objective: To observe the effects of Astragalus polysaccharide on Post antibiotic effect (PAE) of ciprofloxacin in immunosuppression mice that pretreated by Astragalus polysaccharide. Method: The MIC/MBC value of ciprofloxacin on standard strains of Staphylococcus aureus (ATCC25923) in vitro were measured by using two times dilution method and colony counting method. Mice were orally administrated of Astragalus polysaccharide 250 mg．kg-1for one week, and on third and sixth day mice were given cyclophosphamide 150 mg．kg-1or 100 mg．kg-1to induce immune suppression through intraperitoneal injection. By using the method of inducing PAE in vitro, bacteria liquid which containing 2MIC ciprofoxacin was prepared. Then the immunosuppression model mice were infected by above bacteria liquid, and the effects of Astragalus polysaccharides on PAE of ciprofoxacin in vivo were observed. And the blood leukocyte count and the thymus/spleen index were measured in mice. Result: The MIC and MBC of ciprofoxacin on ATCC25923 were 0.06 µg．mL-1～ 0.125 µg．mL-1and 0.25 µg．mL-1～ 1µg．mL-1respectively in vitro. Compared with control group, the spleen and thymus index and white blood cell counting of model group were significantly decreased (P＜0.01), which indicated that the immunosuppression model in mice was successful. In the later stage of infection, compared with the model group, Astragalus polysaccharide could improve the thymus/spleen index and white blood cell counting in mice. Compared the ciprofoxacin group with (ciprofoxacin + astragalus polysaccharides) group, the later group also showed the improving effects on organ index and white blood cell counting. But no signifcant difference on PAE of ciprofoxacin was observed by pretreatment with Astragalus polysaccharide in vivo. Conclusion: Astragalus polysaccharide can increase the function of nonspecifc immunity in immune suppressed mice which infected by Staphylococcus aureus, but can not extend the PAE of ciprofoxacin in vivo in the same mice model.

Astragalus polysaccharide; ciprofoxacin; antibacterial effect in vivo

R 285.5

A

1674-926X(2014)02-021-04

四川省教育厅自然科学重点项目(09ZA027,13ZA028)

成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与 开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

何敏（1987-），女，硕士研究生在读，从事中药药理及毒理研究

Tel:13699449392 Email:364801391@qq.com

曾南（1969-），女，教授，博导，主要从事中药药理及毒理研究 Email:zengnan966@126.com

2013-10-12