牛彦波，吴皓琼，殷 博，曹亚彬，安 琦

(1.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨150020;2.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150010)

化学除草是现代农业不可分割的一部分，咪草烟(又名咪唑乙烟酸)为大豆田常用的长效广谱化学除草剂，由于其除草效果好、杀草谱广、用药量少、使用方便、用药成本低，被广泛应用。虽然因其对后茬作物有较强的药害，被限制使用，但仍不能禁止。前茬大豆田施用咪唑乙烟酸的地块，后茬一年内不得改种玉米、小麦、大麦、烟草;一年半内不得改种棉花、向日葵，两年内不得改种水稻、高梁和谷子;三年内不得改种油菜、马铃薯、瓜类和蔬菜;四年内不得改种甜菜、亚麻［1］。研究发现:在不同的土壤中咪草烟的半衰期不同，在偏碱性的土壤中咪草烟的降解速率较快，在酸性、有机质丰富的土壤中咪草烟的降解速率缓慢，其在土壤中的降解主要依赖微生物作用［2，3］。因此筛选获得高降解活性的咪草烟降解菌尤为重要，本研究从被咪草烟污染的大豆田土壤分离筛选咪草烟降解菌，获得一株编号为T04细菌，咪草烟的最高降解率达到99.2%，经生化鉴定与分子鉴定，该菌株为阴沟肠杆菌复合菌(Enterobacter cloacaecomplex)。在目前的文献中还未发现该属菌株对咪草烟的降解特性，故本研究的发现丰富了咪草烟降解菌范畴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤

采自黑龙江省讷河市被咪草烟污染的大豆田土壤。

1.1.2 药品

10%咪草烟水溶剂为市售，咪草烟原药为98.5%的纯度，其他化学药品均为分析纯。

1.1.3 培养基配方

无机盐培养基:K2HPO40.1 g、CaCO30.04 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.1 g、FeSO4·7H2O 0.001 g、(NH4)2SO40.1g、H2O 1000 mL，pH 7.0 ～7.2。

LB 培养基:牛肉膏 3.0 g 、蛋白胨 10.0 g、NaCl 5.0 g、H2O 1000 mL，pH 7.0 ～7.2。

若制成固体培养基需在上述培养基中加入18.0 g琼脂粉。灭菌温度为121℃，20 min。咪草烟的添加量依实验的具体要求。

1.2 方法

1.2.1 菌株筛选

初筛:将土样经过风干、粉碎、过筛处理后，称取5.0 g土样加入到以咪草烟为唯一碳源和能源的100 mL无机盐培养基中，该无机盐培养基中加入10%的咪草烟水剂3 mL，培养温度30℃，转数160 r/min经过5～7 d的液体摇床培养。

复筛:将10 mL初筛培养物在复筛培养基中经过连续2次的连续复筛培养，每次均增加无机盐培养基中咪草烟的含量，咪草烟的添加量依次为5 mL、10 mL。

菌株分离纯化:用1 mL无菌吸管吸取1 mL最后一次复筛的培养物，加入到9 mL无菌水中进行10倍稀释，用1 mL无菌吸管吸取0.1 mL各梯度稀释液，加入每百毫升含10%咪草烟0.5 mL的固体无机盐培养平板中，用玻璃刮扒涂匀，在30℃的恒温培养箱中培养，1～3 d后观察。挑取生长快的菌落进行划线分离培养，直至获得单菌落为止。

菌株功能验证:将分离得到的单菌落分别再转入每百毫升含10%咪草烟0.5 mL的无机盐培养基中和LB培养基中培养，观察菌株在培养液中的生长情况，并测定发酵液的菌密度OD600值，将生长迅速、菌密度高的培养物再进行划线分离反复纯化与培养，获得稳定的目标菌株。

1.2.2 T04 菌株的鉴定

菌株生化鉴定采用梅里埃VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统，利用 GN板测试。菌株16SrDNA序列测定委托宝生物工程(大连)有限公司进行，结果在NCBI进行比对。结合菌体形态特征、革兰氏染色等，参照《伯杰细菌鉴定手册》第8版，及《常见细菌系统鉴定手册》最终确定种属关系。

1.2.3 T04 菌株降解能力

菌株在不同培养基上的降解能力比对:用无菌接种环挑取1环T04的斜面纯培养物，分别接入每百毫升含纯度为98.5%咪草烟0.3 g的无机盐培养液中和每百毫升含纯度为98.5%咪草烟0.5 g的LB培养基中，在30℃、150 r/min振荡培养2～3 d后，采用液相色谱测定发酵液中的咪草烟残留量［4］，以不加菌的各培养液为CK对照，计算咪草烟的降解率。

菌株在不同咪草烟浓度中的降解:用无菌接种环挑取1环T04的斜面纯培养物，分别接入每百毫升含10%咪草烟0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL 的 LB 培养液中，每个3次重复，在30℃、150 r/min振荡培养2～3 d后，采用液相色谱测定发酵液中的咪草烟残留量。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

经过高浓度液体富集培养方法，从平板中初步分离得到6株细菌，经过验证试验(菌株筛选验证结果见表1)，其中编号T02、T04、T06的3株菌在以咪草烟为唯一碳源和能源的无机盐培养基中，经振荡培养4～5 d均可良好生长，说明此3株菌都能够单一利用咪草烟，进行菌体的繁殖，而其他3株菌在咪草烟的利用方面，表现力弱。在添加了咪草烟的LB培养基中6株菌均能良好生长，但T02、T04、T06的菌密度仍高于其余3株菌，其中T04在2种培养基中的菌密度都最高，说明菌株T04对咪草烟的利用更好，并且菌株的繁殖力更强。故而对T04菌株做进一步的测试工作。

表1 菌株在含咪草烟的不同培养基中的生长情况Tab.1 The growth of strains in different media containing imazethapyr

2.2 T04 菌株鉴定

T04菌株在无机盐培养基上生长缓慢，而在营养丰富的LB培养基上生长迅速，菌落微黄，扁平，表面湿润，边缘整齐，在20×100倍光学显微镜下观察，菌体为短杆状、无芽孢、G－，无荚膜。生理生化试验显示明胶液化缓慢，赖氨酸不脱羧，有精氨酸双水解酶，甘油或肌醇发酵不产气，可利用丙二酸盐作为碳源。结合菌株16SrDNA测序结果，在NCBI上进行比对，绘制T04菌株的系统进化树，确定T04菌株为阴沟肠杆菌复合菌(Enterobacter cloacae complex)。具体生化反应结果见表2。菌株16SrRNA序列见图2，菌体照片见图1。

表2 T04菌株在GN生化板上的反应结果Tab.2 The biochemical reaction results of T04 strain in GN

图2 T04菌株在NCBI上的系统进化树Fig.2 The blast tree of T04 based on NCBI

2.3 菌株降解能力

通过表3和表4表明，在无机盐培养基中T04菌株对咪草烟的降解率比对照(不接菌的培养基)在相同的时间里高51.8%，而在LB培养基中高94.1%，菌株T04在含量超过0.2 mL10%咪草烟LB培养基中的降解率较高，最高达到99.2%，在含0.1 mL10%咪草烟的培养基中的菌株对咪草烟的降解率只有24.5%，这可能是因为发酵液中的咪草烟含量低，不足以对菌株的代谢途径加以调节，且培养基中的营养物质足以维持菌株繁殖所致，而在添加量超过0.2时菌株的代谢受到咪草烟的调控，可能是咪草烟的添加使菌株的代谢方式有所改变，菌株的活性得到提高，说明适量的咪草烟添加对菌株的生长有利;同时发现菌株的菌密度高，菌株的降解率也高，说明菌株的降解活性高低与菌株的生长密不可分，呈正相关性;并且LB发酵液中丰富的营养不仅对菌株的生长有利，同时也提高了菌株的降解活性。

表3 T04在不同培养基上降解咪草烟效率Tab.3 The imazethapyr degradation efficiency of T04 strain in the different media

表4 在咪草烟不同浓度水平下的降解效率Tab.4 Degradation of imazethapyr at different concentration levels

3 结论

通过咪草烟高浓度、梯度富集培养的方法从咪草烟污染土壤中分离得到6株可利用咪草烟繁殖的细菌，其中3株菌的咪草烟降解能力较稳定，由于T04繁殖力最强，故而对其进行了鉴定，综合分析后确定菌株T04为阴沟肠杆菌复合菌(Enterobacter cloacae complex)。采用液相色谱对咪草烟残留量进行分析后发现，在不同的养分环境中，菌株对咪草烟的降解能力差别较明显，菌株虽可营自养生长，但更适宜异养生活，咪草烟适宜的添加量对菌株的活力有影响，至于影响的深度需要做进一步的研究。这样的发现也使得菌株的田间应用有了理论的基础，因为咪草烟在有机质丰富的土壤中难以降解［3］，而该菌株的异样生活方式，使得菌株具有了未来应用的空间。

［1］ 常秋红，黄巧云.大豆田除草剂使用品种及化除技术［J］.上海农业科技，2013，(06):139—141.

［2］ 黄安太，车军.咪草烟在不同土壤和水体中的残留动态研究［J］.安徽农业科学，2007，35(33):10769—10770.

［3］ 李宏园，陶波.除草剂咪唑乙烟酸在土壤中的归趋［C］∥长春:杂草科学与环境及粮食安全.2004:416—420.

［4］ 周艳明，张寒松.反相高效液相色谱法检测大豆中咪草烟［J］.食品科学，2010，31(08):237—240.