刘芳 王伟 陈连凤 方全 严晓伟

.基础研究.

敲低ABCG1慢病毒表达载体的构建及功能检测

刘芳 王伟 陈连凤 方全 严晓伟

目的 为探讨人急性单核细胞白血病细胞系(THP-1)中胆固醇转运相关的ABCG1基因的表达对动脉粥样硬化发生发展的作用，构建ABCG1慢病毒干扰载体，并验证干扰效果、进行功能检测。方法 针对人ABCG1的cDNA序列，设计两个RNA干扰的寡核苷酸单链DNA。将其插入到慢病毒表达载体上；将构建的载体和包装质粒共转染293T细胞；通过实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹检测干扰载体对ABCG1表达水平的影响；通过检测外流率进行功能验证。结果 构建的ABCG1基因的小干扰RNA慢病毒表达载体感染THP-1细胞可以有效地抑制ABCG1 mRNA和蛋白表达水平，且减少ABCG1介导的胆固醇外流，感染组外流率小于对照组(23.87%±0.45%比30.57%±1.00%，P＜0.001)。结论 慢病毒表达载体成功敲低THP-1细胞的ABCG1，并为后续的ABCG1在巨噬细胞中生物学作用的研究创造条件。

ABCG1； 慢病毒载体； RNA干扰

ABCG1是三磷酸腺苷结合盒转运体超家族中的一员。它们遍及多个种类，包括细菌、鱼、鸟和哺乳动物。它是一种跨膜糖蛋白，经膜以ATP依赖的方式转运各种物质包括外源化学物质、多肽和脂质等。临床和动物实验提示，ABCG1在动脉粥样硬化的发生发展过程中可能发挥重要的作用［1-3］。ABCG1对维持细胞内胆固醇和脂质平衡起着至关重要的作用［4-5］，但至今仍然缺乏对其在物质转运及对巨噬细胞功能影响的机制方面的研究，所以利用人急性单核细胞白血病细胞系(human acute monocytic leukemia，THP-1)研究该基因的功能及其分子机制具有十分重要的意义。普通转染小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)的方法效率低且表达不稳定，我们采用构建慢病毒载体的小发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)技术在THP-1细胞中抑制ABCG1的表达，以期为ABCG1的后续研究创造条件。

1 材料与方法

1.1 材料

THP-1细胞来自ATCC细胞库，人胚肾293T细胞由本实验室保存；慢病毒表达载体购自上海吉满公司，包括pGMLV-SC5RNAi慢病毒载体和GM easyTMLentiviral Mix质粒；大肠杆菌DH5α感受态细胞、转染试剂LipofectAMINE 2000、NBD-胆固醇、TRIzol均购自Invitrogen公司；佛波酯(PMA)、HDL购自Sigma公司；RPMI1640/DMEM培养基及胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司；限制性内切酶、DNA连接酶、反转录酶购自Fermentas公司；实时定量PCR试剂购自TaKaRa公司；质粒大抽试剂盒为Qiagen公司产品；兔抗人ABCG1抗体购自Abcam公司；兔抗人GAPDH和辣根过氧化物酶耦联的IgG购自Santa Cruz公司；引物由上海生工生物工程公司合成；质粒测序由Invitrogen公司完成；实时定量PCR仪为ABI 7500 Fast型。

1.2 shRNA慢病毒载体的构建

针对ABCG1基因序列，设计两条shRNA干扰靶点序列，然后设计合成两对shRNA寡核苷酸单链DNA，退火形成双链。将两对双链shRNA oligo分别连接到酶切回收的pGMLV-SC5RNAi载体，构建两个shRNA慢病毒重组质粒并转化至感受态细胞DH5α，挑取若干单菌落测序鉴定。ABCG1 shRNA-1的上游序列5’-gatcc GGACCTGCTGAATGGACATCT TTCAAGAGAAGATGTCCATTCAGCAGGTCCTTTTTT g-3’，下游序列5’-aattc AAAAAAGGACCTGCTGAA TGGACATCTTCTCTTGAAAGATGTCCATTCAGCAGG TCC g-3’；ABCG1 shRNA-2的上游序列5’-gatcc GCTGGACACAGTTACTAATGCTTCAAGAGAGCATT AGTAACTGTGTCCAGCTTTTTTg-3’，下游序列5’-aattcAAAAACTGGACCAGTTACTATCTCTCTTGAAGC ATTAGTAACTGTGTCCAGCg-3’。阴性对照shRNA上游序列5’-gatcc GTTCTC CGAACGTGTCACG TTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAG-3’，下游序列5’-aattcACGCGTAAAAAAGTTCTCCGAACGTG TCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAC g-3’。

1.3 慢病毒包装和病毒滴度测定

293T细胞用含10%FBS的DMEM培养基培养在10 cm培养皿中，接种量以转染时细胞密度达到80%为宜，接种24 h后进行转染。将抽提的慢病毒shRNA重组质粒10 μg及其辅助包装原件载体质粒10 μg与1 ml无血清DMEM培养基混合，加入Lipo2000转染试剂60 μl混匀，室温放置15 min，均匀滴加到培养皿中，37℃，5%CO2孵箱培养18 h。换液后继续培养48 h后吸取细胞上清液，收集病毒。将293T细胞按照每孔8 000个细胞接种96孔板培养过夜，感染时细胞长至30%～50%的融合度，将病毒液用含10%FBS的细胞培养液进行梯度稀释加入每孔细胞中，第3天去除含慢病毒的培养基，加入100 μl的完全培养基。第5天在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞的数量。病毒滴度=表达荧光的细胞数×稀释倍数。

1.4 Western blot评价靶基因干扰效果

将THP-1细胞接种于6孔板中，培养在含10% FBS的RPMI 1640培养基中。用含polybrene 5 μg/ml的完全培养基按感染复数100稀释病毒原液，含有阴性对照shRNA、ABCG1-shRNA1和ABCG1-shRNA2的病毒稀释液加到细胞中。感染48 h后更换培养液，感染第6天在倒置荧光显微镜下检测感染效率。将含嘌呤霉素1 μg/ml完全培养基筛选THP-1细胞3周。收集空白、对照及ABCG1干扰的细胞提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。各取50 μg总蛋白量，10%SDS-PAGE电泳，电泳结束后转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶室温封闭1 h，ABCG1兔单克隆抗体(1∶1 000稀释)4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶耦联的羊抗兔IgG，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，增强型化学发光法显色3 min显影。

1.5 细胞RNA提取和实时定量PCR检测

收集对照和分别感染了阴性shRNA、ABCG1-shRNA1和ABCG1-shRNA2的THP-1细胞，加入TRIzol提取细胞总RNA，取2 μg进行反转录，得到cDNA模板，通过实时定量PCR仪分别扩增ABCG1 cDNA(引物为Forward 5’-AGGATTTGGGTCTGA ACTGC-3’，reverse5’-CTCACCAGCCGACTGTTCTGA)和GAPDH内参基因(引物为Forward 5’-GTCTCC TCTGACTTCAACAGCG，reverse 5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’)。根据实时荧光定量PCR反应曲线得到各样品的目的基因和内参基因Ct值，采用ΔΔCt方法进行基因表达相对定量。

1.6 胆固醇外流率测定

结合Western blot和实时定量PCR结果，选用沉默效果较好的ABCG1-shRNA2构建稳定THP-1细胞株。THP-1细胞的胆固醇外流检测参照文献［6］步骤进行。酶标仪分别检测细胞裂解液和诱导外流液的荧光强度(FI)。细胞内胆固醇外流率=诱导外流液FI/(细胞裂解液FI+诱导外流液FI)× 100%。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 ABCG1 shRNA慢病毒载体的构建及慢病毒滴度测定

转化后挑取ABCG1 shRNA慢病毒载体克隆，DNA测序结果显示重组克隆中插入pGMLVSC5RNAi序列与设计的oligo序列完全一致，表明ABCG1-shRNA慢病毒载体构建成功。慢病毒shRNA感染细胞后96 h荧光照片如图1。含有10× 10-9ml ABCG1-shRNA1和shRNA2慢病毒液的培养孔中观察到表达绿色荧光细胞至少为10个，则ABCG1-shRNA1和shRNA2的病毒滴度为:10 TU/ (10×10-9)ml=1×109TU/ml。

2.2 ABCG1-shRNA对ABCG1基因表达的影响

图1 THP-1细胞慢病毒ABCG1-shRNA1和shRNA2感染细胞96 h后荧光照片

在ABCG1表达丰富的THP-1细胞中，分别感染ABCG1-shRNA1和ABCG1-shRNA2及对照shRNA，收集蛋白，用ABCG1抗体进行蛋白免疫印迹验证(图2)。结果表明，与空白和阴性载体对照相比，对照GAPDH蛋白内参表达，ABCG1-shRNA1与ABCG1-shRNA2均能明显抑制内源性ABCG1蛋白的表达。由此可见，ABCG1-shRNA1和ABCG1-shRNA2对靶基因都有较好的沉默效果。

图2 Western blot检测ABCG1 shRNA的敲低效果

2.3 ABCG1-shRNA对ABCG1基因转录水平的影响

THP-1细胞空白组、阴性载体对照组、ABCG1-shRNA1组及ABCG1-shRNA2组中，分别提取细胞总RNA，利用实时定量PCR鉴定ABCG1-shRNA的抑制效果(图3)。实时定量PCR结果表明，与空白及阴性载体对照组相比，ABCG1-shRNA1及ABCG1-shRNA2的mRNA水平沉默效率分别为0%和57%，表明构建的ABCG1-shRNA2能够有效抑制THP-1细胞ABCG1基因的转录水平。

图3 实时定量PCR检测ABCG1-shRNA的敲低效果

2.4 ABCG1表达对细胞胆固醇外流的影响

由HDL诱导ABCG1介导的巨噬细胞胆固醇外流中，shRNA2感染组的THP-1细胞外流率(23.87%±0.45%)小于对照组(30.57%± 1.00%)及阴性载体感染组(30.00%±1.31%)(均为P＜0.001)，对照组与阴性载体感染组外流率差异无统计学意义。

3 讨论

巨噬细胞胆固醇外流是胆固醇逆向转运过程的关键环节，在机体对抗动脉粥样硬化过程中发挥重要作用。ABCG1是在细胞膜表面表达的转运蛋白，通过介导细胞内胆固醇向细胞外HDL转运参与巨噬细胞胆固醇外流［7］。ABCG1在巨噬细胞和内皮细胞中高表达，在调节脂质平衡、胆固醇逆转运及动脉粥样硬化中起重要作用。近几年来，ABCG1敲除的动脉模型与动脉粥样硬化关系的研究结果并不一致。Out等［8］在LDLR-/-小鼠将巨噬细胞ABCG1基因敲除，主动脉粥样硬化斑块面积显著增加，提示ABCG1在小鼠体内发挥着抗动脉粥样硬化作用；而Baldan等［9］和Ranalletta等［10］将ABCG1基因缺失小鼠的骨髓移植到LDLR-/-小鼠后，后者主动脉粥样硬化程度显著减轻；对冠心病患者的研究提示ABCG1可能具有促动脉粥样硬化作用［3］。所以，目前巨噬细胞ABCG1在动脉粥样硬化中的作用仍不清楚，需要更多的实验来证实。构建ABCG1敲除或过表达的巨噬细胞模型有助于我们研究ABCG1对巨噬细胞功能影响的具体的分子机制，同时揭示ABCG1可能在动脉粥样硬化中的作用。而通过shRNA慢病毒包装感染的方法是构建稳定敲低ABCG1的巨噬细胞模型的一种有效手段。为了验证ABCG1干扰后对巨噬细胞的功能是否有影响，我们检测了ABCG1介导的胆固醇外流，实验表明ABCG1干扰后的巨噬细胞胆固醇外流明显小于对照组，因此慢病毒载体的ABCG1干扰效果不仅在基因的表达上还在功能上得到了证实。

RNA干涉(RNA interference，RNAi)是近几年来新兴的实验技术，由一些短片段的双链RNA通过促使特定基因mRNA的降解来高效、特异地阻断体内该基因的表达，诱使细胞表现出该基因缺失的表型。目前常用的RNAi的研究策略有3种:第一种即为直接合成针对靶基因的siRNA(合成的是RNA，不是DNA)，通过转染的方法使之进入细胞内，参与到RNAi途径，发挥使靶基因沉默的效应。这一方法受转染效率的影响较大，而且能顺利地进入RNAi途径的效率如何，还有待验证；二是构建shRNA的质粒表达载体，转染细胞，在细胞内转录生成shRNA，利用细胞内的Dicer酶，生成相应的siRNA，发挥RNAi作用；三是构建shRNA的病毒表达载体，常用的病毒载体有腺病毒载体、慢病毒载体等，机制与质粒载体相似，利用了病毒感染细胞效率比较高的特点，解决了用质粒载体转染效率低的缺陷［11］。本课题组在THP-1细胞预实验中，使用siRNA瞬时转染及质粒载体转染，发观转染效率非常低下，不能够建立ABCG1低表达的THP-1细胞模型。因此，我们利用病毒感染效率高的特点选择shRNA慢病毒表达载体感染THP-1细胞的方法，得到了稳定低表达ABCG1的细胞系。

本实验使用的pGMLV-SC5RNAi慢病毒载体结构为CMV-eGFP-U6-MCS-PGK-Puromycin，通过限制性内切酶BamHⅠ(GGATCC)和EcoRⅠ(GAATTC)使pGMLV-SC5载体线性化，连接入目的RNAi序列，构建为带有目的RNAi序列的慢病毒载体。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。实验证实，我们构建的ABCG1-shRNA2慢病毒表达载体可以降低ABCG1基因的蛋白表达水平，同时也能有效抑制ABCG1的转录水平。但ABCG1-shRNA1慢病毒表达载体降低蛋白水平但对转录水平没有抑制作用，可能与RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISCRISC)的剪切形式及功能有关。RISC分为两大类型:剪切型RISC和非剪切型RISC。剪切型RISC具有两种功能:进行靶mRNA的剪切或是对翻译进行抑制，而究竟发挥哪种功能依赖于小RNA与靶mRNA之间的互补程度。如果shRNA与靶mRNA之间的互补程度不是很广泛，则shRNA与其靶mRNA之间形成的扭曲螺旋可使靶mRNA无法到达剪切型RISC的剪切活性位点，从而只能发挥对翻译的抑制作用，而不能发挥对mRNA的剪切作用［12］。

综上所述，ABCG1 shRNA慢病毒载体的成功构建并稳定感染THP-1细胞，为进一步研究ABCG1在巨噬细胞多方面的功能打下了坚实的基础。

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Construction of a lentiviral vector of ABCG1 short hairpin RNA and function detection

Liu Fang，Wang Wei，Chen Lianfeng，Fang Quan，Yan Xiaowei.
Department of Cardiology，Peking Union Medical College Hospital，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Science，Beijing 100730，China

Objective To investigate the biological function of human lipid transporter gene ABCG1 in THP-1 cell line in the development and progression of atherosclerosis，the lentiviral vector of ABCG1 short hairpin RNA(shRNA)was constructed and its knockdown effect and function was determined.Methods ABCG1 shRNA was designed and constructed based human ABCG1 cDNA sequence using a lentiviral vector. The expression of ABCG1 was measured by real-time PCR and Western blot，and function was examined by Cholesterol efflux assay.Results Construct of lentiviral vector effectively inhibited ABCG1 mRNA and protein levels and decreased the ABCG1-mediated cholesterol efflux from THP-1-derived macrophages. (infection group:23.87%±0.45%vs.control group:30.57%±1.00%，P＜0.001).Conclusions A lentivirus RNA inference vector targeting ABCG1 gene is successfully constructed，which provided THP-1 cell model for further detection of ABCG1 function.

ABCG1； Lentivirus vector； RNA interference

Yan Xiaowei，Email:xswy-pumc@163.com

2014-02-20)

(本文编辑:谭潇)

This work was supported by a grant from the National Natural Sciences Foundation of China(No.81270381).

10.3969/j.issn.1007-5410.2014.04.009

国家自然科学基金面上项目(81270381)

100730中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院心内科

严晓伟，电子信箱:xswy-pumc@163.com