吕莎莎，刘宽芝

辛伐他汀降低2型糖尿病大鼠心肌Toll样受体4表达

吕莎莎，刘宽芝

目的：观察辛伐他汀对2型糖尿病大鼠心肌 Toll样受体4（TLR4）表达的影响。

Toll样受体4；辛伐他汀；糖尿病心肌病变；炎症反应

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:64.)

糖尿病性心脏病严重威胁糖尿病患者的生命，约占糖尿病患者死因的70%～80%[1]。目前，天然免疫系统的激活和慢性低度炎症为糖尿病并发症的发病机理提供了新依据，Toll样受体4（TLR4）是免疫反应和介导炎症的重要模式识别受体，也是联系二者的枢纽，因此可将TLR4作为炎症和自身免疫性疾病的治疗靶点。辛伐他汀的抗炎作用对降低2型糖尿病患者的心血管病风险具有重要意义。本文探讨辛伐他汀对糖尿病大鼠心肌TLR4表达的影响。

1 材料与方法

主要材料：40只雄性清洁级SD大鼠，鼠龄6周，体重为（180±20）g，购自河北医科大学动物实验中心。链脲佐菌素（美国Sigma公司生产），辛伐他汀[默沙东制药有限公司产品（批号：X920345）]，兔抗大鼠TLR4蛋白抗体（武汉博士德生物工程有限公司生产），兔二步法免疫组化试剂盒（北京中杉生物科技有限公司，PV-6001），逆转录试剂盒（加拿大立陶宛Fermentas公司），脱氧核糖核酸（DNA）引物（北京赛百盛生物有限公司）。

动物模型制备及分组：于2012-03至2013-11将40只雄性SD大鼠随机分为对照组（n=10）和实验组（n=30）。其中对照组予以普通饲料，实验组用高糖高脂饲料（普通饲料中加入20%白砂糖、2.5%胆固醇、15%熟猪油）喂养。4周后，实验组腹腔内一次性注射链脲佐菌素（30 mg/kg），对照组腹腔注射等体积的枸橼酸缓冲液。实验组30只大鼠6周后测定空腹血糖＞7.8 mmol/L且伴有胰岛素敏感指数降低者作为2型糖尿病大鼠模型[2]，共26只，将其随机分为糖尿病组（n=13）和辛伐他汀组（n=13）。辛伐他汀组给予20 mg/（kg.d）辛伐他汀灌胃，对照组和糖尿病组均予等体积生理盐水灌胃[3]，共8周。

标本采集及生化指标检测：实验结束时，用10%水合氯醛（3.5 ml/kg）麻醉大鼠，心脏取血，离心，留取血清标本，-20℃保存，待用于生化指标的测定。迅速取部分心脏组织以4%多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，常规切片，待苏木素伊红（HE）染色和免疫组织化学染色。空腹血糖以Roch血糖仪测定；肌酸激酶及血脂采用全自动生化分析仪（日本olympus公司生产）检测；空腹胰岛素水平用双抗体放射免疫分析法检测；胰岛素敏感指数=1/（空腹血糖×空腹胰岛素水平）。

光镜观察：切片常规脱蜡至水，HE染色3 min，自来水洗1 min，1%盐酸乙醇分化30 s，自来水洗1 min，HE染色2 min，自来水洗1 min，梯度乙醇脱水，二甲苯胺透明，中性树脂封片，光镜观察。

免疫组织化学法检测TLR4表达：心脏组织标本用4%甲醛固定后脱水、浸蜡包埋、切片，按照免疫组化试剂盒说明进行操作。一抗为1:200稀释的TLR4蛋白抗体。二氨基联苯胺显色剂显色后充分冲洗，HE复染，脱水，透明，封片。光镜下每张切片选取5个视野，应用Image-Pro Plus 6.0病理图像分析软件计算TLR4阳性表达的光密度平均值[累积光密度（IOD）/面积（Area）]。

逆转录多聚酶链反应法（RT-PCR）检测TLR4表达：提取总的核糖核酸（RNA）后逆转录合成互补脱氧核糖核酸（cDNA），再用cDNA进行多聚酶连反应。反应条件: 94℃预变性3 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，72℃延伸5 min，共40个循环。TLR4引物：上游引物： 5'-TCAGTGTGCTTGTGGTAG-3'，下游 引 物： 5'-TCTGCTAAGAAGGCGATAC-3'， 片段长度458 bp；β-actin引物的序列：上游引物5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，下游引物：5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，片段长度150 bp。扩增产物行1% 琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察、拍照及分析，且应用Image J凝胶图像分析处理系统计算目的片断TLR4/β-actin条带的OD比值。

统计学处理：应用SPSS 13.0统计学软件处理实验数据。所有数据均进行正态性检验、方差齐性检验，服从正态分布资料以均数±标准差表示，偏态分布以中位数、四分位数间距表示。多组比较采用单因素方差分析，组间比较应用SNK检验。均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

生化指标变化：糖尿病组和辛伐他汀组的空腹血糖均明显高于对照组（P＜0.05）；而前两组间的空腹血糖无统计学差异（P＞0.05）。糖尿病组、辛伐他汀组的甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平均明显高于对照组，辛伐他汀组的甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平低于糖尿病组（P＜0.05）。三组大鼠的高密度脂蛋白胆固醇、肌酸激酶比较无统计学差异（P＞0.05）。表1

表1 大鼠生化指标的变化（）

表1 大鼠生化指标的变化（）

注：与对照组比较*P＜0.05，与糖尿病组比较△P＜0.05。肌酸激酶采用中位数（四分位数间距）表示

组别 例 空腹血糖(mmol/L)甘油三酯(mmol/L)总胆固醇(mmol/L)低密度脂蛋白胆固醇(mmol/L)高密度脂蛋白胆固醇(mmol/L) 肌酸激酶 (U/L)对照组 10 5.92±1.28 0.80±0.21 2.47±0.59 1.21±0.29 1.87±0.33 952 (623)糖尿病组 13 12.04±2.04* 1.86±0.22* 5.15±1.09* 2.13±0.17* 0.67±0.17* 1307(1430)辛伐他汀组 13 11.23±2.61* 1.13±0.27*△ 3.30±0.91*△ 1.67±0.33*△ 1.27±0.30 1375(741)

心肌形态学改变：对照组大鼠心肌细胞排列规则，细胞结构清晰，胞核似椭圆形或长方形，胞质清晰，偶见炎细胞。糖尿病组心肌细胞结构不清，细胞明显水肿,可见广泛心肌纤维断裂，间质充血，大量炎细胞浸润。辛伐他汀组的心肌改变较糖尿病组明显减轻。图1

图1 三组大鼠心肌HE染色（×100）

心肌Toll受体4蛋白表达水平：心肌TLR4蛋白表达主要表现为心肌细胞胞质内的棕黄色颗粒沉着。对照组大鼠心肌有少量表达，呈浅棕黄色；糖尿病组TLR4的蛋白表达明显高于对照组，呈棕黄色；辛伐他汀组TLR4的表达较糖尿病组明显减少，但仍多于对照组（图2）。糖尿病组的IOD/Area （0.6157±0.0233）是对照组（0.3210±0.0151）的192%（P＜0.05）；辛伐他汀组IOD/Area（0.4302±0.0224）是糖尿病组的69.87%（P＜0.05），两者差异均有统计学意义。

逆转录多聚酶链反应法分析心肌TLR4 mRNA表达水平：心肌TLR4 mRNA的表达结果以rTLR4表示（rTLR4＝TLR4 OD值/β-actin OD值）。糖尿病组大鼠心脏rTLR4（1.43±0.16）是对照组（0.42±0.06）的341%（P＜0.05）；辛伐他汀组（0.73±0.13）是糖尿病组的51.05% （P＜0.05），两者差异均有统计学意义。图3。

图2 免疫组织化学染色法检测大鼠心肌 Toll样受体4蛋白表达（×200）

图3 各组大鼠心脏心肌 Toll样受体4 信使核糖核酸的表达

3 讨论

本实验复制2型糖尿病大鼠模型，HE染色示心肌细胞结构不清，细胞水肿、变性，广泛性心肌纤维断裂，间质充血，大量炎细胞浸润等，说明糖尿病大鼠已经出现心肌病变，但肌酸激酶水平与对照组比较无统计学差异，推测此时处于病变的早期，因此尚需延长实验时间以进一步观察。研究发现静脉内皮细胞中活化TLR4通过TLR/核因子-κ B（NF-κ B）信号传导通路介导非耐受性炎症反应[4]。Reyna等[5]发现2型糖尿病患者肌肉组织中TLR4 mRNA表达和蛋白质含量明显升高，且其抑制蛋白-κB（IKB）／NF-κ B信号通路激活程度也增加。但国内外对于TLR4与糖尿病性心肌病变之间关系的研究尚不多见，吴铿等[6]发现TLR4与肿瘤坏死因子-α在糖尿病心肌灌注的炎性损伤中具有重要作用。本实验糖尿病大鼠HE染色显示心肌发生了炎症和损伤，免疫组织化学染色和RT-PCR结果显示与正常对照组比较，糖尿病组TLR4的蛋白和mRNA表达水平明显升高，这说明TLR4可能参与了糖尿病心肌病变的发生、发展。

在糖尿病状态下，TLR4的表达水平明显升高，可能与下列因素有关：高血糖能激活蛋白激酶C和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶，从而诱导TLR4表达，进而通过一系列反应引起NF-κ B易位进入细胞核内，致炎症反应的发生，使心肌受损、细胞凋亡、血管内皮重构、心室肥厚及心脏功能障碍等[7]；2型糖尿病患者存在体重增加、胰岛素抵抗、氧化应激增强等，这些可使TLR4内源性配体热休克蛋白60、游离脂肪酸、内毒素等增多，从而激活TLR4-NF-κ B信号通路，致TLR4表达增加、细胞因子及炎性介质释放，引发炎症反应。TLR4的表达水平升高，又可促进糖尿病心肌病变的发生发展[8]。TLR4与各种内外源性配体结合后，可通过一系列蛋白质级联反应激活NF-κ B抑制蛋白激酶（IKK），激活的IKK一方面通过丝氨酸磷酸化增加，减弱胰岛素信号通路，最终产生胰岛素抵抗；另一方面通过降解NF-κ B抑制因子a，从而调控炎性反应因子的表达，从而间接导致胰岛素抵抗[9]。通过上述两种途径导致胰岛素抵抗，进而加速心肌病变的发生发展。总之，在TLR4的参与下，各机制之间相互作用，共同参与糖尿病心肌病变的发生发展。

有研究表明，他汀类药物能降低健康人及高胆固醇血症患者外周血单核细胞表面TLR4表达及其下游的信号分子[10-12]。Satoh等[13]发现阿托伐他汀可通过MicroRNA let-7i的表达下调冠状动脉疾病患者的TLR4信号，从而发挥抗炎作用。本实验中辛伐他汀组与糖尿病组相比，TLR4的蛋白和mRNA表达水平明显降低，且心肌细胞水肿、变性，心肌纤维断裂，间质充血，炎细胞浸润等情况亦明显减轻，说明辛伐他汀可能通过下调心脏TLR4 的表达而抑制TLR4信号转导通路，阻断细胞因子及炎性介质的释放，从而发挥对心肌病变的保护作用。但由于干预时间短且无阳性对照，因此尚需更多的动物实验和临床研究去进一步证实。

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Simvastatin Reducing the Expression of Myocardial Toll Like Receptor 4 in Type 2 Diabetic Rats

LV Sha-sha, LIU Kuan-zhi.

Department of Endocrinology, the Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang (050051), Hebei, China

LIU Kuan-zhi, Email: Liu-kuanzhi@163.com

Objective: To observe the effect of simvastatin on reducing the expression of myocardial Toll like receptor 4 (TLR4) in type 2 diabetic rats.Methods: A total of 40 male SD rats were divided into 2 groups, Control group, n=10, the rats had normal feed and Experimental group, n=30, the rats received hyperglycemia and hypelipaemia feed for 6 weeks. There were 26 experimental rats with fasting blood glucose ＞7.8 mmol/L def i ned as diabetic rats and divided into 2 groups, Diabetic group, the rats received the normal saline, and Simvastatin group, the rats received simvastatin 20mg/(kg.d) for 8 weeks. n=13 in each group. The myocardial tissue was examined by optical microscopy, TLR4 protein and mRNA expressions were measured by immuno histochemistry and RT-PCR respectively in different groups.Results: Compared with Control group, the myocardial tissue in Diabetic group showed obvious edema and inf l ammatory cell inf i ltration, those damages were much less in Simvastatin group. The immuno-histochemistry and RTPCR presented that TLR4 protein and mRNA expressions in Diabetic group (0.6157 ± 0.0233) and (1.43 ± 0.16) were signif i cantly higher than those in Control group (0.3210 ± 0.0151) and (0.42 ± 0.06) all P<0.05. The TLR4 protein and mRNA expressions in Simvastatin group (0.4302 ± 0.0224) and (0.73 ± 0.13) were lower than Diabetic group but higher than Control group, all P<0.05.Conclusion: Simvastatin may reduce the expressions of TLR4 protein and mRNA and decrease the inflammatory reaction therefore protect the cardiac tissue in experimental rats.

Toll like receptor 4; Simvastatin; Diabetic cardiopathy; Inf l ammatory reaction

2013-09-03）

（助理编辑：许菁）

050051 河北省石家庄市,河北医科大学第三医院 内分泌1科

吕莎莎 硕士研究生 主要从事糖尿病与代谢性疾病的研究 Email: 413969935@qq.com 通讯作者：刘宽芝Email: Liu-kuanzhi@163.com

R54

A

1000-3614（2014）01-0064-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.01.017

方法：40只雄性SD大鼠随机分为对照组（n=10）和实验组（n=30）。其中对照组给予普通饲料，实验组用高糖高脂饲料喂养。6周后测定空腹血糖＞7.8 mmol/L且伴有胰岛素敏感指数降低的大鼠作为2型糖尿病大鼠模型，共26只，将其随机分为糖尿病组（n=13）和辛伐他汀组（n=13）。干预治疗8周。留取心脏组织做光镜观察，分别采用免疫组织化学染色和逆转录多聚酶链反应法（RT-PCR）检测各组大鼠心肌TLR4蛋白和信使核糖核酸（mRNA）的表达。

结果：与对照组比较，光镜下可见糖尿病组心肌细胞明显水肿，并可见大量炎细胞浸润，辛伐他汀组心肌组织损伤较糖尿病组明显减轻。免疫组织化学染色和RT-PCR显示，糖尿病组大鼠TLR4蛋白和mRNA表达分别为0.6157±0.0233和1.43±0.16，明显高于对照组（0.3210±0.0151和0.42±0.06，P＜0.05）；辛伐他汀组大鼠TLR4 蛋白和mRNA表达分别是0.4302±0.0224和0.73±0.13，低于糖尿病组（P＜0.05），但仍高于对照组（P＜0.05），差异均有统计学意义。

结论:辛伐他汀从蛋白和mRNA水平下调2型糖尿病大鼠心肌TLR4的表达、降低炎症反应，进而发挥对心脏的保护作用。