刘洋，李浪，苏强，周游，王江友，孙羽涵，杨栋

强化阿托伐他汀对不稳定性心绞痛患者冠状动脉介入治疗术后CD4+T淋巴细胞微小核糖核酸-21表达的影响*

刘洋，李浪，苏强，周游，王江友，孙羽涵，杨栋

目的：探讨强化阿托伐他汀对不稳定性心绞痛患者经皮冠状动脉介入治疗(PCI）术后CD4+T淋巴细胞微小核糖核酸-21（microRNA-21，miRNA-21）表达的影响。

阿托伐他汀；微小核糖核酸-21；经皮冠状动脉介入治疗术；PDCD4； CD4+T淋巴细胞

(Chinese Circulation Journal, 2014,29: 26.)

经皮冠状动脉介入治疗(PCI）是目前治疗冠心病先进而有效的手段之一,在迅速开通病变冠状动脉恢复心肌血供的同时常常也可引起术后心肌损伤，是临床常见而棘手的并发症，是患者近远期预后不良的独立预测因子，临床上缺乏有效的防治方法。因此，探索术后心肌损伤机制与防治的研究日益受到人们的重视。

既往研究发现，不稳定性心绞痛急性反应期可激活CD4+T淋巴细胞,并致使肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-10等炎症因子分泌异常，CD4+T淋巴细胞尤其Th1细胞，参与了不稳定动脉粥样硬化斑块的发生、发展过程[1]。PCI可诱发或促进不稳定斑块破裂，导致外周血T淋巴细胞的显著激活，诱导促炎因子肿瘤坏死因子-α分泌增加，促进心肌局部炎症的发生发展[2]。

微小核糖核酸（MicroRNA，miRNA）是一类广泛存在基因组非编码区的小分子RNA。近年发现，miRNA调控CD4+T淋巴细胞活化、分化，参与免疫炎症反应[3]。新近研究发现miRNA-21通过负调控其靶基因程序性细胞死亡因子4（PDCD4）从而限制过度激活的炎症反应[4]。有研究表明，miRNA-21表达上调可减少促炎因子肿瘤坏死因子-α分泌，促进抑炎因子白细胞介素-10释放，抑制CD4+T淋巴细胞亚型Th1细胞过度活化的炎症反应[5,6]。因而miRNA-21在CD4+T淋巴细胞介导的免疫炎症反应中具有重要作用。

Patti等[7]研究结果表明，PCI术前2天给予80 mg大剂量的阿托伐他汀，可以有效的降低炎症指标C反应蛋白水平，明显减轻术后心肌损伤，推测该效益可能归因于阿托伐他汀抗炎作用。虽然目前他汀类药物在防治PCI术后心肌损伤中的作用机制尚未完全阐明，但众多研究已表明他汀具有抑制心肌炎症反应作用，而术后心肌CD4+T淋巴细胞被激活，诱发心肌炎症反应是明确的[8]。 因此我们的研究目的观察强化阿托伐他汀对不稳定性心绞痛患者PCI围术期CD4+T淋巴细胞miRNA-21表达的影响，为PCI术后心肌损伤的临床防治提供理论依据。

1 资料与方法

实验对象：选取2011-11至2012-05入住我院行择期PCI的不稳定性心绞痛患者68例(男58例，女10例)，年龄（63±10）岁，随机分为强化他汀组（术前2天给予阿托伐他汀80 mg/d，术后改为阿托伐他汀40 mg/d，n=34）和常规他汀组（术前及术后均给予阿托伐他汀20 mg/d，n=34），两组均为术前2天首次服用阿托伐他汀。不稳定性心绞痛患者均经冠状动脉造影证实存在冠状动脉狭窄，有行PCI指征，且术前心肌酶学标记物肌酸激酶同工酶（CK-MB）和肌钙蛋白I阴性，无他汀应用禁忌证，初发心绞痛、劳累恶化性心绞痛和静息性心绞痛等。排除标准：合并严重感染或肿瘤患者；严重肝肾功能不全者；他汀类药物过敏者；脑卒中；左心室射血分数＜30%；急诊PCI。

试剂：人淋巴细胞分离液（中国），Dynabeads®FlowComp™人 CD4淋巴细胞试剂盒（挪威 ），RevertAid™FistStrand cDNA逆转录试剂盒(立陶宛)，Fase Start Universal SYBR Green 实时荧光定量聚合酶链式反应试剂盒(美国)，All-in-one™微小核糖核酸实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)试剂盒(美国)，miRNA-21引物（美国），PDCD4 mRNA、甘油醛磷酸脱氢酶mRNA引物（中国），兔抗人PDCD4单抗（美国），GAPDH单抗(中国)，人肿瘤坏死因子-α 酶联免疫法试剂盒（美国），人白细胞介素-10超敏酶联免疫法试剂盒（中国）。

标本采集：强化他汀组和常规他汀组术前、术后16～24 h均抽血检查肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白I、超敏C反应蛋白（由我院检验科检测）及新鲜外周血，其中取1 ml新鲜外周血自然凝固20 min，2000 rpm离心10 min,收集血清用酶联免疫法检测肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-10。余下用肝素抗凝后分离细胞。本试验遵照广西医科大学医学伦理委员会人体试验管理规范执行。标本采集均获患者知情同意并签署同意书。

细胞提取：根据Ficoll-Paque密度梯度离心法提取两组患者外周血单个核细胞(PBMC)细胞，严格按照Dynabeads®FlowComp™人 CD4淋巴细胞磁珠分选试剂盒说明书操作分选CD4+T淋巴细胞。分选出的细胞同样做细胞计数，同时用0.4%台盼蓝染色观察并计算出活细胞存活率，存活率＞90%的CD4+T淋巴细胞留下备用。

实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应检测miRNA-21、PDCD4 mRNA表达量：按照 Trizol操作说明提取CD4+T淋巴细胞的总RNA，根据RevertAid™FistStrand cDNA逆转录试剂盒说明书和All-in-one™miRNA实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应试剂盒说明书分别将PDCD4 mRNA及miRNA-21逆转录成cDNA。根据Fase Start Universal SYBR Green实时荧光定量聚合酶链式反应试剂盒说明书和All-in-one™miRNA实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应试剂盒说明书分别加入不同组分，总反应体系均为20 μl。miRNA-21及内参U6引物由GeneCopeia公司提供（引物ID分别为：hsmq-0057和hsnRNAU6），PDCD4引物：上游：5’-AACTGTGCCAACCAGTCCAA-3’，下游：5’-TCTTCTCAAATGCCCTTTCATC-3’；GAPDH引物：上游：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’下游：5’- GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’，按试剂盒说明设置反应体系及参数，每个样本均做复孔检测，同时每次反应均设置阴性孔。实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应产物经过测序检测。结果采用2-ΔΔCT法比较。

蛋白免疫印迹法检测各组 PDCD4 蛋白的表达：分选出的CD4+T淋巴细胞中加入100 μl蛋白裂解液混匀，然后在4℃下13 201×g离心20 min，提取上清转移至新离心管中，然后用二辛可宁酸（BCA）法[15]检测蛋白浓度，内参为甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH）。配置12%分离胶和5%浓缩胶，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转膜40 min，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗（稀释比例1:2500）4℃敷育过夜，脱色摇床上用磷酸盐吐温洗脱液洗膜5次，红外荧光二抗（稀释比例1:5000）室温敷育2 h后在双色红外激光成像系统扫描成像。odyssey 3.0软件分析目标条带及内参条带灰度值，以目标PDCD4条带灰度值与内参甘油醛磷酸脱氢酶条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

酶联免疫法检测各组肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-10浓度：将收集的血清标本及培养基上清和elisa试剂盒常温下放置约30 min，根据试剂盒说明书操作，于酶标仪下读取450 nm的OD值，根据标准曲线计算出样本的浓度。

统计学处理：应用SPSS 13.0统计软件对数据做统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，正态性分析采用Kolmogorov-Smirnov检验，两组间比较采用成组设计t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验；计数资料以频数和构成比表示，采用卡方检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组一般临床资料比较

两组在既往冠心病史、吸烟史、高血压、糖尿病史、药物治疗、术前CK-MB及肌钙蛋白I等方面差异均无统计学意义（P均＞0.05）。表1

表1 两组患者一般资料比较

表1 两组患者一般资料比较

注：CK-MB：肌酸激酶同工酶。1 mmHg=0.133 kPa

项目 强化他汀组 (n=34) 常规他汀组 (n=34)男性[例 (%)] 30 (88.24) 27 (79.41)年龄 (岁) 62.54±9.35 65.57±11.45高血压[例 (%)] 21 (61.76) 19 (55.88)糖尿病[例 (%)] 9 (26.47) 7 (20.59)血脂异常[例 (%)] 10 (29.41) 12 (35.29)冠心病史[例 (%)] 9 (26.47) 6 (17.65)吸烟史[例 (%)] 18 (52.94) 14 (41.18)收缩压 (mmHg) 128.29±31.17 127.40±30.10舒张压 (mmHg) 79.35±8.61 78.76±8.90术前肌钙蛋白I阴性[例 (%)] 34 (100) 34 (100)术前CK-MB (U/L) 14.53±5.70 14.73±5.53药物治疗[例 (%)]阿司匹林 34 (100) 34 (100)氯吡格雷 34 (100) 34 (100)血管紧张素转换酶抑制剂 30 (88.24) 31 (91.18) β受体阻滞剂 25 (73.53) 23 (67.65)钙离子通道阻滞剂 11 (32.35) 8 (23.53)硝酸酯类 18 (52.94) 20 (58.82)

2.2两组患者支架置入情况比较

两组病变血管部位、病变血管支数及支架置入数等差异均无统计学意义（P均＞0.05）。表2

2.3两组患者心肌损伤标记物术后高于正常高值的发生率比较

强化他汀组肌钙蛋白I高于正常高值1～5倍的发生率低于常规他汀组（17%和30%），高于正常高值5倍以上的发生率也低于常规他汀组（30%和56%），差异均有统计学意义（P均＜0.05）。强化他汀组CK-MB高于正常高值的发生率也低于常规他汀组（分别为25%和38%），差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

表2 两组患者病变血管部位、支数及支架置入情况比较

表2 两组患者病变血管部位、支数及支架置入情况比较

注：1 atm=101.325 kPa

项目 强化他汀组 (n=34) 常规他汀组 (n=34)病变血管左前降支[例（%）] 27 (79.41) 29 (85.29)左主干[例（%）] 4 (11.76) 5 (14.71)左回旋支[例（%）] 17 (50.00) 12 (35.29)右冠状动脉[例（%）] 20 (58.82) 13 (38.24)单支血管病变[例（%）] 20（58.82） 22（64.71）两支血管病变[例（%）] 12（35.29） 15（44.12）多支血管病变[例（%）] 5（14.70） 7（20.59）每个病人支架置入数（枚） 1.61±0.80 1.44±0.78平均支架长度（mm） 24.88±7.64 23.08±8.24平均支架直径 (mm) 3.00±0.40 3.00±0.52支架释放压力（atm） 12.71±2.64 11.80±2.35

2.4两组患者PCI术前术后超敏C反应蛋白、miRNA-21、PDCD4 mRNA、PDCD4蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-10表达量的比较

常规他汀组术后超敏C反应蛋白、PDCD4 mRNA、PDCD4蛋白、肿瘤坏死因子-α较术前明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。强化他汀组术后miRNA-21、白细胞介素-10表达量较术前明显升高，PDCD4 mRNA、PDCD4蛋白较术前明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。表3，图1

表3 两 组 患 者PCI术 前 术 后 超 敏C反 应 蛋 白、miRNA-21、PDCD4 mRNA、PDCD4蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-10表达量的比较

表3 两 组 患 者PCI术 前 术 后 超 敏C反 应 蛋 白、miRNA-21、PDCD4 mRNA、PDCD4蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-10表达量的比较

注：与本组术前比较*P＜0.05。PCI：经皮冠状动脉介入治疗 miRNA-21：微小核糖核酸-21；PDCD4：程序性细胞死亡因子

常规他汀组 (n=34) 强化他汀组 (n=34)术前 术后 术前 术后超敏C反应蛋白(mg/L) 1.69±0.24 3.34±0.3* 1.83±0.18 1.69±0.25 miRNA-21 0.68±0.39 0.82±0.34 0.7±0.41 2.02±0.9*PDCD4 mRNA 7.83±2.32 9.54±1.68* 8.06±2.1 6.99±1.89*PDCD4蛋白 1.13±0.42 1.69±0.58* 1.38±0.54 0.83±0.44*肿瘤坏死因子-α (pg/ml) 15.20±9.92 26.25±9.32*15.56±7.28 17.29±7.13白细胞介素-10 (pg/ml) 7.60±2.83 7.36±3.78 8.82±5.31 11.38±6.64*

图1 两组患者PCI术前后PDCD4蛋白表达量电泳图

3 讨论

PCI是冠心病介入治疗目前最有效手段之一，在开通病变冠状动脉的同时常常也可引起心肌损伤，主要临床表现为心肌损伤标记物肌钙蛋白I水平的升高，预后不良。术中经皮球囊扩张、支架置入等挤压斑块，损伤血管内皮，诱导单核细胞合成炎性细胞因子等激发炎症反应。PCI术后心肌损伤与炎症反应密切相关，是围术期心肌损伤的重要病因之一[9]。阿托伐他汀在血管成形术中减少心肌损伤的系列研究结果表明[7]，PCI前给予强化他汀治疗可减少术后心肌损伤，改善患者预后。在本研究中，与常规他汀组（阿托伐他汀20 mg/d）比较，术前2天给予强化他汀（阿托伐他汀80 mg/d）治疗可有效降低术后心肌损伤标记物肌钙蛋白I及CK-MB高于正常高值的发生率，更能减少PCI术后肌钙蛋白I高于正常高值5倍的发生率（2012年全球心肌梗死工作组将PCI术后心肌梗死定义为超过肌钙蛋白I 99%正常高值达5倍以上），这说明了PCI术前给予强化他汀药物治疗更能减少术后心肌损伤，起到心肌保护作用。超敏C反应蛋白是急性期蛋白，与炎症反应程度呈正相关[10]。PCI术后两组患者超敏C反应蛋白均比术前升高，常规他汀组升高更为明显，而强化他汀组可以缓解超敏C反应蛋白上升趋势，表明术前强化他汀治疗能有效减轻PCI术后炎症反应，起到术后心肌保护作用。

既往研究表明，冠心病患者体内存在CD4+T淋巴细胞的过度激活[11]，尤其CD4+T淋巴细胞亚型Th1细胞过度增殖，并致使肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-10等各种炎症因子的分泌失衡,参与了不稳定粥样斑块的发生、发展过程[1]，PCI术则进一步加重CD4+T淋巴细胞介导的炎症反应[2]。miRNA-21既往发现具有心肌保护作用，主要参与心肌细胞的生长及分化[12]，抑制血管生成[13]。Yin等[14]通过动物实验证实，缺血再灌注损伤可使大鼠心肌细胞中miRNA-21的表达显著上调，将miRNA-21注入大鼠体内可显著减少缺血再灌注损伤所致的心肌细胞梗死面积，从而起到心肌保护效应,这一效应可能与miRNA-21具有潜在调控炎症反应的作用有关[15]。

研究发现，miRNA-21具有抑制免疫炎症反应的作用。Lu等[16]的研究发现抑制CD4+T淋巴细胞miRNA-21表达能加重Th1介导的炎症反应，减少Th2细胞分泌抗炎因子，表明促进miRNA-21表达可抑制CD4+T淋巴细胞亚型Th1过度激活的炎症反应。PDCD4是miRNA-21的靶基因[4]，研究发现敲除小鼠PDCD4基因后，小鼠抵抗炎症的能力增加，淋巴细胞分泌白细胞介素-10炎症因子明显增多，肿瘤坏死因子-α浓度减少[17]。在CD4+T淋巴细胞中，miRNA-21负调控PDCD4蛋白表达[18]。将miRNA-21前体转染至CD4+T淋巴细胞诱导miRNA-21表达增加，可明显抑制PDCD4蛋白表达，导致白细胞介素-10分泌增多[19],抑制miRNA-21表达可使肿瘤坏死因子-α表达增加[6]。这些结果提示上调miRNA-21表达，可负调控其靶基因PDCD4蛋白，从而促进CD4+T淋巴细胞分泌白细胞介素-10增多，抑制肿瘤坏死因子-α表达。

阿托伐他汀在血管成形术中减少心肌损伤的系列研究发现，PCI术前给予大剂量阿托伐他汀，能够有效的降低炎症因子水平，减少术后心肌损伤的发生率，明显改善患者近、远期预后[7]。阿托伐他汀能够抑制T淋巴细胞的生长、增殖、活性，促进白细胞介素-10表达增加，抑制肿瘤坏死因子-α。肿瘤坏死因子-α是启动级联炎症反应的关键因子，与PCI术后心肌损伤密切相关[20]。白细胞介素-10又称细胞因子合成抑制因子，能抑制多种炎症因子包括肿瘤坏死因子-α分泌，减轻炎症反应发生、发展[21]。Derkacz等[22]的表明，血清白细胞介素-10的增加可有效减少PCI术后心肌炎症损伤。

本研究发现，PCI术前给予80 mg大剂量的阿托伐他汀， CD4+T淋巴细胞miRNA-21表达增多，其靶标PDCD4表达减少，血清白细胞介素-10分泌增多，肿瘤坏死因子-α浓度减少，而常规组miRNA-21上调不明显，PDCD4蛋白表达增加，肿瘤坏死因子-α浓度增多，这些结果提示，强化阿托伐他汀减少PCI术后心肌损伤，可能部分通过上调CD4+T淋巴细胞miRNA-21的表达，抑制靶蛋白PDCD4，促进血清白细胞介素-10分泌，降低肿瘤坏死因子-α浓度而起效。这一发现，为PCI术后心肌损伤的防治提供了新的理论思路。

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Effect of Intensive Atorvastatin Up-regulating CD4+T Lymphocyte MicroRNA-21 Expression on Reducing the Post PCI Myocardial Injury in Patients With Unstable Angina Pectoris

LIU Yang, LI Lang, SU Qiang, ZHOU You, WANG Jiang-you, SUN Yu-han, YANG Dong.

Department of Cardiology, The First Aff i liated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning (530021), Guangxi, China Corresponding Author: LI Lang, Email: drlilang@163.com

Objective: To explore the intensive atorvastatin up-regulating CD4+T lymphocyte microRNA-21 (miRNA-21) expression on reducing the post PCI myocardial injury in patients with unstable angina pectoris (UAP).Methods: A total of 68 UAP patients received elective PCI in our hospital from 2011-11 to 2012-05 were enrolled and randomized into 2 groups. Intensive group, the patients were treated by atorvastatin 80 mg/d before PCI and 40 mg/d after PCI. Routine group, the patients received atorvastatin 20 mg/d before and after PCI, n=34 in each group. The creatine kinase-MB (CK-MB), Troponin I (CTnI) and high sensitivity C-reactive protein (hs-CRP) were examined before and at 16-24 h after the operation. The miRNA-21 and programmed cell death 4 (PDCD4 ) mRNA in CD4+T lymphocyte were detected by RT-PCR, the PDCD4 protein expression was measured by Western blot analysis, the interleukin-10 (IL-10) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were checked by ELISA.Results: ①In Intensive group, the incidence for CTnI at 1-5 times higher or above 5 times higher than normal value and the incidence for CK-MB higher than normal value were all lower than those in Routine group, all P<0.05. ②In Routine group, the post operational hs-CRP and TNF-α levels, the PDCD4 mRNA and protein expressions were signif i cantly increased thanthey were before the operation, all P<0.05.③In Intensive group, the post operational miRNA-21 and IL-10 expressions were increased, the PDCD4 mRNA and protein expressions were decreased than they were before the operation, P<0.05.Conclusion: The intensive atorvastatin treatment may reduce the post PCI myocardial injury, which might be related to upregulating CD4+T lymphocyte miRNA-21 expression and therefore, resulted in decreased expression of target protein PDCD4.

Atorvastatin; MicroRNA-21; Percutaneous coronary intervention; Programmed cell death 4; CD4+T lymphocyte

2013-08-22）

（编辑：王宝茹）

国家自然科学基金资助项目（81260042，81160046），广西硕士研究生科研创新项目（YCSZ2013033） , 广西科学研究与技术开发计划资助项目（桂科攻1140003A-19）

530021 广西壮族自治区南宁市，广西医科大学第一附属医院 心血管内科

刘洋 硕士研究生 主要研究方向：冠心病介入治疗及其防治 Email：timedie@foxmail.com 通讯作者：李浪 Email：drlilang@163.com

R54

A

1000-3614（2014）01-0026-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.01.008

方法：入选2011-11至2012-05在我院住院行择期PCI术的不稳定性心绞痛患者68例，随机分为强化他汀组（阿托伐他汀术前80 mg/d，术后40 mg/d，n=34）和常规他汀组（阿托伐他汀术前术后均20 mg/d，n=34）。分别于PCI术前、术后16～24 h抽血检查肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌钙蛋白I、超敏C反应蛋白及新鲜外周血。实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应法（qRT-PCR）检测CD4+T淋巴细胞miRNA-21、程序性细胞死亡因子4（PDCD4）mRNA表达，蛋白免疫印迹法检测CD4+T淋巴细胞PDCD4蛋白表达，酶联免疫法检测血清白细胞介素-10、肿瘤坏死因子-α的浓度。

结果：强化他汀组肌钙蛋白I高于正常高值1～5倍及高于5倍以上的发生率低于常规他汀组；强化他汀组CK-MB高于正常高值的发生率也低于常规他汀组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。常规他汀组术后超敏C反应蛋白、PDCD4 mRNA、PDCD4蛋白、肿瘤坏死因子-α较术前明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。强化他汀组术后miRNA-21、白细胞介素-10表达量较术前明显升高，PDCD4 mRNA、PDCD4蛋白较术前明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

结论： 强化阿托伐他汀减轻PCI术后心肌损伤可能与上调PCI术后CD4+T淋巴细胞miRNA-21表达，导致其靶蛋白PDCD4表达减少有关。