刘宝山，纪超伦，杨向东，苗润静，张 蕾，王兴丽，马 霖

(1. 天津医科大学总医院，天津 300052；2. 天津中医药大学，天津 300193； 3. 天津中医药大学第一附属医院,天津 300193)

再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)简称再障，是一种可能由不同病因和机制引起的骨髓造血功能衰竭症。免疫介导的骨髓造血抑制是AA最常见、最重要的发病机制，是一种自身免疫性疾病[1]。特别是T细胞介导的细胞免疫功能异常参与了再障的发生与发展。研究证实，AA患者发病期间，T淋巴细胞表面的正调控分子CD28上调，负调控共刺激因子CTL相关抗原-4(CTLA-4)下调，平衡偏于Th1免疫，T细胞处于“预激活”状态[2]。因此，阻断CD28/mTOR/S6该通路就可能诱导T细胞无能，发挥免疫抑制作用，调节免疫应答及耐受，恢复再障患者造血功能重建。

薯蓣科植物具有“活血舒筋，消食利水，祛痰，截疟”的功效[3]。穿龙薯蓣的主要化学成分为甾体皂苷类，主要为薯蓣皂苷(dioscin)、延属皂苷(trillin),是用于合成多种甾体激素类药物的薯蓣皂苷元(diosgenin)的重要原料之一，具有调节机体免疫的作用。本研究应用穿龙薯蓣皂苷治疗再生障碍性贫血小鼠，观察其对T细胞异常激活途径中p-mTOR、p-S6表达的影响，探讨该药抑制再生障碍性贫血免疫异常的作用机制。

1 材料

1.1 动物与用药

BALB/c小鼠，雌雄各半，DBA/2小鼠，6～8周龄，体质量(20 g±2 g)，购自北京华阜康生物科技股份有限公司(检疫合格号SCXK<京>2009-0004)。穿龙薯蓣皂苷(北京康仁堂药业有限公司提供)，环孢素软胶囊(华北制药股份有限公司生产，产品批号100501)，雷公藤多苷片(浙江得恩德制药有限公司，产品批号1007119)。

1.2 试剂与仪器

异丙醇(华北地区特种试剂开发中心)，DTT(Sigma分装)，Go Taq Green Master mix(Promega M7123)，Oligo(dT)18 Primers(TaKaRa D511)，Ribonuclease inhibitor(TaKaRa D2310A)，dNTP Mixture(TaKaRa D4030A)，M-MLV Reverse Transeriptase(Promega M1701)，QuantiTectTM SYBR Green PCR Kit(QIAGEN 204143)，DL2000(TaKaRa)。实时定量PCR仪(杭州博日科技有限公司Linegene9620)，PCR仪(杭州博日科技有限公司TC-96/g/h(b))，去离子水仪(PALL, Purelab Plus，美国)。

2 方法

2.1 再障模型的建立

按姚军[4]等方法制备免疫介导的再障小鼠模型。

2.1.1 胸腺、淋巴结悬液的制备 将DBA/2小鼠断颈处死，75%乙醇浸泡3 min；无菌取出胸腺及颈部、领下、腋窝等处淋巴结；加少量生理盐水，轻轻研磨后过滤，使成单细胞悬液；细胞计数，将胸腺和淋巴结细胞按1∶2比例混合；台盼蓝染色鉴定细胞活性，活性细胞应达95%以上；计数并配成所需浓度5×106备用。

2.1.2 制备再障模型小鼠 BALB/c小鼠经60Coγ射线计量为6.0 Gy均匀全身照射；于4 h内无菌尾静脉输入预先取自DBA/2小鼠的胸腺淋巴结混合细胞，输入细胞数为1×106/只。

2.1.3 模型评估 于输注细胞后第2天小鼠眶丛静脉取血，枸橼酸钠抗凝，全自动生化仪计数血细胞数。并取正常BALB/c小鼠作为对照组。取上述小鼠的双侧尺骨常规固定，梯度脱水；经低温塑料包埋，室温下尺骨矢状面切片(3ūm)，HE-Giemsa染色，镜下观察小鼠骨髓组织。根据血常规及骨髓象判定成模。

2.2 分组与处理

选取健康BALB/c小鼠140只，适应性喂养7 d，按随机数字表法选出20只设为正常对照组，其余分为模型组、西药对照环孢素组、中药对照雷公藤多苷组、中药治疗高剂量组、中药治疗中剂量组、中药治疗低剂量组6组各20只。①正常对照组、模型组灌胃生理盐水，每次 0.2 ml，每日1次；②西药对照组：成模后给予环孢素软胶囊23.5 mg/kg/d灌胃，每日1次；③中药对照组：成模后给予雷公藤多苷9.36 mg/kg/d灌胃，每日1次；④低剂量组：成模后给予薯蓣皂苷37.44 mg/kg/d灌胃，每日1次；⑤中剂量组：成模后给予薯蓣皂苷74.88 mg/kg/d灌胃，每日1次；⑥高剂量组：成模后给予薯蓣皂苷149.76 mg/kg/d灌胃，每日1次。各组连续灌胃14 d，第15天定为取材时间。

2.3 血常规

分别于造模前、造模后第1天与治疗后第15天目内眦取血，采用全自动血细胞分析仪检测血常规。

2.4 实时荧光定量RT-QPCR检测再障小鼠p-mTOR/p-S6基因的表达

取组织样品(大约30～100 mg)用TRIZOL法，提取总RNA。加入核苷酸引物制备cDNA模板。应用Real-time PCR Master Mix 的方法进行Real-time PCR，以β-actin作为内参对照。mtor上游引物为：5′ AGA ACC AGC CCA TAA GAA AGC 3′；mtor下游引物为：5′ AGA GAA ATC CCG ACC AGT GAG 3′。PS6上游引物为： 5′ CTC TCA GTG AAA GTG CCA ACC 3′；PS6下游引物为： 5′ AGA GAA TTT GAC TGG GCT GAC 3′(引物由上海生物工程有限公司合成)。PCR反应体系总体积为20 μL，QuantiTectTM SYBR Green PCR mix 10 μL, cDNA 2 μL, 上、下游引物各1 μL，蒸馏水6 μL。PCR反应条件：95℃预变性 10 min；94℃变性20 s；59℃退火加延伸20 s，40个循环；57℃～96℃绘制熔解曲线。应用2-ΔΔct(comparative ct method od quantitation, ΔΔCt)法进行数据统计处理。

2.5 Western Blot法检测再障小鼠p-mTOR/p-S6蛋白的表达

2.5.1 小鼠骨髓单个核细胞 (BMMNC)分离培养 治疗后第15天断颈处死小鼠，无菌条件下取双侧股骨，用带有5号针头的5 ml注射器吸取RPMI1640培养液，反复冲洗骨髓腔，将骨髓细胞收集在灭菌离心管内并反复吹打，使骨髓细胞充分分散制成悬液。将充分混匀的细胞悬液以1∶1比例加在淋巴细胞分离液的表面，离心2000 r/min，10 min，分离出单个核细胞层，移入5 ml离心管内。加入PBS 2 ml反复吹打，离心1000 r/min，10 min，去上清、洗2次。用3 ml1640培养液(青霉素0.0737 g/L，链霉素0.1717 g/L，碳酸氢钠2 g/L，10%胎牛血清)悬浮沉淀细胞，制成悬液计数，经台盼蓝鉴定细胞活性在95%以上，将悬液移入25 ml培养瓶中置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养24 h。

2.5.2 Western Blot法检测p-mTOR/p-S6蛋白 提取的总蛋白样品，根据蛋白定量结果加入相应体积的总蛋白样品与5×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液混合，95℃变性10 min，加至凝胶孔中，进行SDS-PAGE电泳(电压约8 v/cm)。凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上，然后分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。采用PVDF膜作为固相支持物，用湿转的方式将一抗用封闭液稀释1000倍；将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，4℃反应过夜。TBST 洗涤3次,然后将二抗用1×TBST 稀释3000 倍；将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中(室温、避光缓慢摇动)作用60 minTBST洗膜，在暗室中梯度曝光及洗片，使用Image J软件分析。以β-actin作为内参对照，采用美国UVP分析仪器对胶片进行扫描，然后括住每一个条带，系统自动生成灰度值即为结果。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 穿龙薯蓣皂苷对再障小鼠外周血血象比较

表1 穿龙薯蓣皂苷对再障小鼠外周血血象比较

注：与正常组比较：※P<0.05，※※P<0.01；与模型组比较：△P<0.05；与CsA组比较：▲P<0.05；与雷公藤组比较：☆P<0.05

图1 穿龙薯蓣皂苷对再障小鼠外周血血象比较

表1图1显示，造模后再障模型小鼠的血象(WBC、Hb、PLT)均明显低于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)。治疗后各治疗组小鼠血象均有不同程度上升，与模型组、正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。穿龙薯蓣皂苷低、中、高3组组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，以中剂量组最优。其与两者阳性药物对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3.2 穿龙薯蓣皂苷对再障小鼠p-mTOR/p-S6基因表达的影响

表2、3图2显示，模型组p-mTOR基因表达显著上调，各组均明显高于正常组(P<0.01)，治疗后各组均下调p-mTOR基因表达，其中中、高剂量组、CsA组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，中药对照组、低剂量组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组再障小鼠p-mTOR基因表达比较

注：与正常组比较：※P<0.05，※※P<0.01；与模型组比较：△P<0.05；与CsA组比较：▲P<0.05；与雷公藤组比较：☆P<0.05

表3图2显示，模型组p-S6基因表达显著增高，各组均明显高于正常组(P<0.01)，治疗后治疗各组均下调p-S6基因表达，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，穿龙薯蓣皂苷组以中剂量组疗效最好，优于中药对照雷公藤组，次于西药对照环孢菌素A组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组再障小鼠p-S6基因表达比较

注：与正常组比较：※P<0.05，※※P<0.01；与模型组比较：△P<0.05；与CsA组比较：▲P<0.05；与雷公藤组比较：☆P<0.05

图2 各组再障小鼠p-mTOR、p-S6基因表达比较

3.3 穿龙薯蓣皂苷对再障小鼠p-mTOR/p-S6蛋白表达的影响

表4图3、4显示，模型组p-mTOR、p-S6蛋白相对表达量显著增高，各组均明显高于正常组(P<0.01)，治疗后各组p-mTOR、p-S6蛋白相对表达量均下调，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，环孢菌素A组疗效最好，穿龙薯蓣皂苷组以中剂量组疗效最好，优于中药对照雷公藤组，次于西药对照环孢菌素A组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组再障小鼠p-mTOR、p-S6蛋白表达比较

注：与正常组比较：※P<0.05，※※P<0.01；与模型组比较：△P<0.05；与CsA组比较：▲P<0.05；与雷公藤组比较：☆P<0.05

图3 各组再障小鼠p-mTOR、p-S6灰度值

图4 各组再障小鼠p-mTOR、p-S6蛋白表达比较

4 讨论

根据临床表现，再障属于中医学“虚劳”、“血证”、“髓枯”等范畴，其病变部位主要在骨髓。中医认为其病机以肾虚为本，以热毒、瘀血、痰浊为标。再障病程迁延难愈，中医认为“久病必瘀”，因此补肾填精、活血祛瘀为治疗再障的重要原则。西医治疗以免疫抑制剂为主，并取得了较好疗效，目前研究多表明再障是T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病。穿龙薯蓣(Dioscorea nipponica Makino，DNM)为薯蓣科植物，其根茎俗称穿地龙、穿山龙、野山药，为薯蓣科多年生藤本植物穿山龙薯蓣根茎，产于内蒙古、黑龙江等省。其有薯蓣科植物共同的功效，即活血舒筋、消食利水、祛痰截疟。有研究表明，穿龙薯蓣还有免疫调节的作用。宋鸿儒等[5]应用血清药理学方法研究穿山龙总皂苷含药血清对ConA诱导的脾淋巴细胞增殖及其分泌IL-2的影响。结果表明，穿山龙总皂苷含药血清可抑制因ConA诱导的大鼠脾淋巴细胞产生IL -2,对IL-4生成的抑制可能是其抑制T淋巴细胞增殖、抑制大鼠细胞免疫功能的途径之一。舒艳等[6]通过观察穿山龙水煎剂对小鼠免疫系统的作用，研究发现其对小鼠的细胞及体液免疫均有抑制。

目前，研究普遍认为再障患者T细胞亚群失调，CD8+T细胞比例增高且异常活化。T细胞活化需要两种信号，一是TCR与MHC分子-抗原肽复合物特异性结合，二是协同共刺激信号，主要来自APC和T细胞表面黏附分子，其中最重要的是T细胞表面的CD28分子，其与相应配合CD80及CD86结合。TCR/CD3复合体可磷酸化CD28尾部的络氨酸，活化的CD28能进一步磷酸化PI3K[7]，下游的Akt分子可以通过TSC1/TSC2复合体调控mTOR的活化。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是存在于胞浆中一种丝/苏氨酸蛋白激酶，属于磷酸肌醇激酶相关蛋白激酶家族(phosphoinositide kinase -related kinase, PIKK)，mTOR是PI3K/PKB(protein kinase B,PKB)信号通路下游的一个效应蛋白。mTOR是一种大分子蛋白质，分子量为289kDa，是一类进化上非常保守的蛋白激酶家族，广泛存在于各种生物细胞中[8]。mTOR在细胞内可形成两种主要不同复合物，即TOR-Raptor和mTOR-Richtor复合物。Raptor与mTOR氨基端结合，是mTOR调解蛋白，Raptor可能起支架蛋白作用，把mTOR的激酶TOR信号模体TOS( TOR - signalling motif, TOS)和下游底物70S核糖体6激酶S6K1 (p70S6 kinase protein, S6K1)和4E-BP1 ( 4E-binding protein 1, 4E-BP1 ) 联系起来。mTOR下游主要有两个靶蛋白，即核糖体p70S6 激酶( S6K1)和4E-BP1， 4E-BP1是真核翻译起始因子( eIF4E)抑制蛋白，eIF4E从磷酸化的4E-BP 释放后形成活化的eIF4E，促使mRNA翻译[9]。S6K1在细胞内普遍表达是核糖体40S小亚基S6蛋白激酶，其功能主要是使细胞内40S核糖体蛋白S6磷酸化，它可促进含有5’末端寡嘧啶区TOP结构( tract of py-rimidine )mRNA的翻译，而含有5’TOP结构的mRNA翻译的产物主要是核糖体、起始因子和延伸因子等翻译装置的必需组分，因此S6K1的激活可促进蛋白质的合成以及细胞增殖[10]。研究表明，CD28/PI3K/Akt/mTOR/S6信号通路的过度活化与多种肿瘤性疾病的发生发展有密切关系。Murayama T等[11]实验发现，胃癌患者癌细胞p-Akt、p-mTOR表达显著升高，且与肿瘤发展情况呈正相关。另有研究发现，该信号通路与免疫调节密切相关，对小鼠应用RAPA可抑制其mTOR的活性，并导致胸腺退化，T淋巴细胞的生成受到显著抑制[12]。张翔等研究发现，T淋巴细胞内mTOR/S6途径在正常人和初治SAA患者中静息，在再障患者中活化[13]。为阐明穿龙薯蓣皂苷治疗再障的作用机制，前期工作得出穿龙薯蓣皂苷能够明显提高再障小鼠的外周血象，促进造血细胞的恢复的结论，在此基础上完成该实验。

本实验研究结果显示，再障模型组小鼠的p-mTOR、p-S6基因表达显著上调，各组均明显高于正常组，治疗后治疗各组均下调，说明再障发病过程中mTOR/S6基因被异常激活，形成T淋巴细胞高表达，发生自身免疫反应，经过治疗可下调mTOR、S6基因的表达。实验表明，穿龙薯蓣皂苷治疗组p-mTOR基因表达与模型组比较差异有统计学意义，其中以中剂量组p-S6基因表达下调最多，疗效最好，优于中药对照雷公藤组，次于西药对照环孢菌素A组，差异有统计学意义，说明穿龙薯蓣皂苷对于再障发病过程中p-mTOR、p-S6基因表达的调控具有重要意义，疗效肯定。再障模型组小鼠的p-mTOR、p-S6蛋白相对表达量显著增高，各组均明显高于正常组，治疗后各组p-mTOR、p-S6蛋白相对表达量均下调，与模型组比较差异有统计学意义。穿龙薯蓣皂苷组以中剂量组疗效最好，优于中药对照雷公藤组，次于西药对照环孢菌素A组。提示穿龙薯蓣皂苷能够参与调节再障小鼠T淋巴细胞激活过程，对于基于CD28磷酸化途径的T细胞异常激活反应起到一定的抑制作用，抑制p-mTOR、p-S6的表达，阻抑CD28/mTOR/S6/ IFN-γ通路，从而能够拮抗细胞免疫系统造成的再障小鼠骨髓造血细胞的凋亡，发挥免疫抑制作用，起到免疫调节的功效，改善骨髓造血功能，为穿龙薯蓣皂苷治疗再障提供了实验依据。而其对T淋巴细胞靶向杀伤骨髓造血细胞保护以及对造血功能重建的影响及其作用机制还有待于进一步研究。

[1] 郭卫卫,李君梅.再生障碍性贫血机制的研究进展[J].中国医学工程，2011，19(1): 165-166．

[2] 何广胜,周玲,吴德沛,等.CD28 /CTLA-4共刺激分子在再生障碍性贫血免疫发病机制中的作用[J].中华血液学杂志, 2007， 28(9):590-593.

[3] 江苏新医学院.中药大辞典(下册) [M ].上海:上海人民出版社,1977: 1726.

[4] 姚军.淋巴细胞与再生障碍性贫血关系的实验研究[J].中华血液学杂志，1991，12(5)：229-23l.

[5] 王济兴,张风英,宋鸿儒,等.穿山龙总皂苷对大鼠T淋巴细胞功能影响的血清药理学研究[J].时珍国医国药, 2006, 17(9): 1653-1654.

[6] 舒艳.穿龙薯蓣(Dioscorea nipponicaMak. )抗癌活性成分的研究[D ].沈阳:沈阳药科大学, 2006.

[7] Frauwirth KA, Riley JL, Harris MH, et al. The CD28 signaling pathway regulates glucose metabolism[J]. Immunity, 2002, 16: 769-777.

[8] Brown, E. J., M. W. Albers, T. B. Shin, et al. A mammalian protein targeted by G1-arresting rapamycin-receptor complex[J]. Nature, 1994, 369: 756-758.

[9] Hay N, Sonenberg N. Upstream and downstream of mTOR[J]. Genes Dev, 2004, 15,18:1926-1945.

[10] Browne GJ, Proud CG. A novel mTOR-regulated phosphorylation site in elongation factor 2 kinase modulates the activity of the kinase and its binding to calmodulin[J]. Mol Cell Biol, 2004, 24(7):2986-2997.

[11] Murayama T, Inokuchi M, Takagi Y, et al. Relation between outcomes and localization of p-mTOR expression in gastric cancer[J]. Br J Cancer, 2009, 100:782-788.

[12] Luo H, Duguid W, Chen H, et al. The effect of rapamycin on T cell development in mice[J].Eur J Immunol, 1994, 24:692-701.

[13] 张翔,何广胜,吴德沛,等.T淋巴细胞内mTOR/S6途径在难治、复发再生障碍性贫血发病机制中的作用[J].中华血液学杂志,2009,30(10):654-657.