宋文秀， 卢飞艳， 王艳萍， 吴晓媚

(1.广东省珠海市遵义医学院第五附属医院儿科，广东 珠海 519100)

新生儿缺氧缺血性脑病是围生期神经病学中的一个重要的问题，部分存活者有脑性瘫痪等神经系统后遗症，严重影响了人口素质。神经干细胞(Neural stem cells，NSC)是终身具有增殖和分化能力的细胞，可以分化为多种神经细胞，而Nestin是鉴定NSC的重要标记。银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract，GbE)对治疗心脑血管疾病及缺血性脑病等有一定疗效，但具体机制尚未完全清楚。本实验针对HIBD大鼠在GbE治疗前后Nestin蛋白表达的变化进行研究，以此探讨GbE对新生大鼠HIBD的保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 银杏叶提取物 由万荣三九药业提供的舒血宁注射液，每支含总黄酮醇苷1.68 mg，银杏内酯0.28 mg。

1.1.2 Nestin试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司生产。

1.1.3 7 d龄SD大鼠 怀孕的SD大鼠由广东省实验动物中心提供，在我院动物室喂养至产下新生SD大鼠，SD大鼠由母鼠喂养，第7天的大鼠为新生7 d的SD大鼠。SD大鼠母鼠生产前及产后饮食饲料由广东省实验动物中心提供。实验室温度控制在18℃～22℃。

1.2 方法

1.2.1 分组方法 采用随机数字表法，将72只新生7 d的SD大鼠分为假手术组、NS治疗组、GbE治疗组3组。

1.2.2 HIBD动物模型制备方法 首先使用5%丙戊酸钠将SD大鼠麻醉，然后切开颈部皮肤，分离出右侧颈总动脉，并用双线将其两端结扎，然后剪断右侧颈总动脉，缝合切口、皮肤。术后新生鼠恢复2 h后放入8%氧气和92%氮气混合的缺氧舱内2 h后取出，放回母鼠身边继续饲养。

假手术组: 切开颈部皮肤，分离右侧颈总动脉，不结扎，然后缝合皮肤，擦干血迹放回母鼠身边继续饲养。

银杏叶治疗组: 在HIBD术后30 min向小鼠腹腔注射银杏叶提取物(舒血宁注射液)。首剂25 mg/kg，以后每12 h 1次(分别于每天早晨8∶00及夜间20∶00)，直至取材。

NS治疗组: HIBD术后30 min腹腔注射等量NS(注射方法及时间与银杏叶治疗组相同)，直至取材。

1.2.3 标本的制备 3组7 d龄大鼠分别于制模成功后3 d、7 d、14 d、21 d等4个时间点处死，4%多聚甲醛室温固定脑组织24 h后，用石蜡包埋，无水酒精脱水，连续进行皮层、海马CA1区冠状切片，每个时点6 只，每只小鼠切片6张。

1.2.4 Nestin蛋白检测 采用免疫组织化学SABC法，按说明书进行操作。脑组织切片经脱蜡、复水、抗原修复和自然冷却后加封闭液，然后加入一抗(BA1289 Nestin)，4℃温箱过夜(最少16 h)；加二抗生物素化山羊抗兔IgG，37℃温箱中30 min，用PBS(pH7.3)冲洗，DAB显色3～5 min，细胞呈棕黄色为阳性细胞。

1.2.5 图像采集 在Leica BM LB2光学显微镜下观察切片的阳性细胞，采用Viewfinder拍照，用MICRO-COSMOS MiVnT 显微生物图像分析系统对所采图像进行图像分析，统一所有图像光饱和度、亮度和色调，并以Image-pro Ilus 6.0图像分析系统测量平均光密度值(总光密度除以构成被测对象的像素点数)。

2 结果

表1显示，Nestin阳性细胞呈棕黄色，位于胞浆中。阴性对照切片未见Nestin免疫反应产物。假手术组阳性细胞较少，染色淡。生理盐水组阳性细胞数较同时间点假手术组增多，且染色深，在NS治疗3 d后Nestin阳性细胞开始增加，7 d达到高峰，然后表达减弱，与假手术组比较，各个时间点差异有统计学意义(P<0.05)。GbE治疗组阳性细胞数较假手术组、NS组均增多，染色深，于治疗后7 d表达达到高峰，然后表达逐渐减弱，21 d降到最低，3组在各个时间点比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 3组新生大鼠海马Nestin蛋白平均光密度值比较

注：与假手术组比较：*P<0.05，与生理盐水组比较：#P<0.01

3 讨论

HIBD是围生期神经病学中的一个重要问题，是新生儿死亡和导致神经系统后遗症的重要原因之一，严重影响人口素质的提高。HIBD后脑神经细胞出现凋亡和坏死，导致后遗症的发生，受损神经元的修复及再生对HIBD的预后起主要作用。神经干细胞具有多分化潜能，能分化成神经元、星形胶质细胞等CNS的主要细胞，并参与神经功能的修复[1]。哺乳动物体内存在一定数量的神经干细胞，海马的DG和SGZ的神经发生能力可保持终身[2]。Nestin蛋白主要用于神经干细胞的鉴定，在神经系统发生缺血、炎症、肿瘤等病变时，可以诱导Nestin的重新表达[3-4]，即神经干细胞的增殖。新生大鼠HIBD后nestin蛋白表达增加，nestin的表达可能是神经干细胞增殖的结果[5]，增殖的神经干细胞进一步分化为神经元，对受损的神经细胞起到替代作用，进而促进神经功能的恢复[6]。

目前对HIBD尚无有效的治疗方法，急性期以对症、支持治疗为主，后期以康复治疗为主，寻找能减少神经元受损和促进神经细胞再生的药物，可以减少HIBD后遗症的发生。银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract，GbE)为银杏科植物银杏的干燥叶提取物，其主要有效成分为总黄酮醇和银杏内酯，对机体的作用广泛，临床主要用于心脑血管疾病的治疗。既往研究表明，GbE可改善心脑血管的缺血再灌注损伤，清除氧自由基，对减少神经细胞损伤、促进脑功能恢复等方面有很好的作用，近期对临床患者和志愿者的研究进一步肯定了一定剂量的银杏叶能够明显改善认知功能[7-8]。

本实验从神经干细胞角度研究GbE对HIBD的神经保护作用。结果显示，HIBD后Nestin的表达增加，经GbE治疗后nestin的表达较NS组明显增强，治疗3 d后开始增加，于用药7 d时达到最高峰，然后逐渐下降，表现为Nestin先上升后下降的表达趋势。GbE治疗新生鼠HIBD后，脑组织Nestin的表达增加，提示GbE有诱导NESs增殖的作用。而增殖的神经干细胞具体分化为何种神经细胞，本实验未观察，可在以后的实验中明确。

综上所述，GbE可提高HIBD大鼠脑组织Nestin的表达，能够诱导神经干细胞增殖，从而起到神经保护作用。

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