孙 波，江玲丽

（1.国家海洋局第二海洋研究所，浙江杭州 310012；2.舟山出入境检验检疫局，浙江舟山 316021）

鳖源凡隆气单胞菌分离株对稚鳖的致病力

孙 波1，江玲丽2

（1.国家海洋局第二海洋研究所，浙江杭州 310012；2.舟山出入境检验检疫局，浙江舟山 316021）

从发病中华鳖分离得到2株细菌，经Vitek生化反应鉴定为凡隆气单胞菌（Aeromonasυeronii）。通过稚鳖致病力试验与毒力基因分析评估细菌的毒力风险，结果表明，2株凡隆气单胞菌分离株均对稚鳖具有较强的毒力，在24～48 h达到死亡高峰，半数致死量（LD50）分别为6.17与6.05；其肝脏细菌增殖曲线与死亡变化相符，于24～48 h达到峰值（105g-1）。分离株的毒力基因型为aerA+act+alt+ast-。

中华鳖；凡隆气单胞菌；致病力；毒力基因

中华鳖（Trionyχsinens）隶属爬行纲龟鳖目鳖科鳖属，具有很高的营养和药用价值，是我国淡水养殖的名优产品。中华鳖在我国分布广泛，除新疆、西藏和青海外，其他各省均有生产。浙江省作为我国中华鳖养殖的主产区，2012年养鳖产量逾15万t，产值约70亿元，约占全国50%［1-2］。

随着养殖规模的扩大与集约化程度的提高，中华鳖病害发生率不断上升，且常呈现暴发流行，给养殖户带来严重的经济损失，影响了中华鳖养殖业的健康持续发展。先前的研究显示，细菌性病原是引起中华鳖发病最重要的微生物性因素之一［3-7］。气单胞菌属（Aeromonas）细菌是引起中华鳖暴发性死亡的主要病原，也是中华鳖细菌性疾病中引起经济损失最为严重的致病菌［2，6-7］。其中致病性气单胞菌主要包括嗜水气单胞菌（A.hydrophila）与凡隆气单胞菌（A.υeronii）［2，8］。这两种气单胞菌均为人兽鱼共患病原菌，对人类健康与公共卫生存在较大的隐患。鳖源嗜水气单胞菌的致病力研究相对较多，已证实其对稚鳖具有较高的致病力［9-10］；而凡隆气单胞菌对稚鳖的致病力研究则鲜见报道。因此，本研究针对2株采自浙江省发病中华鳖的凡隆气单胞菌分离株，进行种别鉴定，并通过稚鳖攻毒试验与毒力基因分析评估其毒力风险，旨在为中华鳖气单胞菌病的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细菌鉴定

两株凡隆气单胞菌分别分离自2批次发生大规模死亡的中华鳖濒死个体，分别命名为B1与B2。分离株接种于脑心浸液培养基（BHⅠ，青岛海博生物技术有限公司），28℃振荡培养。经革兰氏染色，在油镜下判定其为革兰氏阳性或阴性；据此选择相应的生化测定卡，应用全自动微生物分析仪（Vitek 2 Compact，Biomerieux，France）测定细菌的46个生化指标，与数据库信息进行比对以确定菌种。

1.2 细菌对稚鳖致病力测定

1.2.1 细菌半数致死量

将270只（12±2）g的健康稚鳖随机分为9组，每组30只，适应性饲养5 d后备用。饲养用水为经48 h自然曝气的自来水，水温控制在28℃，pH值7.1，水质符合NY 5051-2001无公害食品淡水养殖用水水质要求。

分离株B1与B2接种于BHⅠ培养基，28℃培养18 h，用无菌生理盐水（0.85%NaCl）将菌液倍比稀释成106，107，108，109m L-1的梯度菌悬液，对8组稚鳖进行菌液腹腔注射，注射部位为后肢近上方的腹面空腔，每只注射0.1 m L，折合实际注射浓度为105，106，107，108只-1；同时对阴性对照组（CK）稚鳖注射等体积的无菌生理盐水。连续观察7 d，记录其死亡情况；同时对濒死中华鳖的肝、肾进行细菌分离和鉴定。根据修正的斯皮尔曼-卡伯分析方法，计算各菌株半数致死量（LD50）［11］。

1.2.2 肝脏细菌含量

将90只（12±2）g的健康稚鳖随机分为3组，每组30只，适应性饲养5 d后备用。饲养用水同1.2.1节所述。分别腹腔注射实际浓度106只-1的B1与B2菌液至1组稚鳖，同时以等体积的无菌生理盐水注射阴性对照组稚鳖。分别于注射后4，24，48，72，96，120 h，每组每次剖取3只稚鳖，对肝脏细菌进行细菌计数。

1.3 毒力基因测定

采用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程有限公司）提取细菌基因组DNA，保存于-20℃备用。应用PCR技术测定气单胞菌4个主要毒力基因，包括气溶素（aerA）与3种重要肠毒素，即细胞毒性肠毒素（act）、不耐热细胞紧张性肠毒素（alt）、耐热细胞紧张性肠毒素（ast）［12］（表1）。为验证PCR产物是否为特异性扩增，每个基因均随机选取20%的扩增片段进行测序、比对。

PCR反应采用25µL反应体系：10×Taq Buffer（含Mg2+）3µL，10 mmol·L-1dNTP Mix 0.6µL，50µmol·L-1上下游引物各0.5µL，DNA模板2µL，Taq DNA polymerase 0.3µL，加双蒸水补足体积。反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸时间按1 000 bp· min-1计算，30个循环；72℃5 min。目的基因、引物序列及退火温度参见表1。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，经Goldview染料染色后用凝胶成像系统分析。产物回收纯化后送至上海英骏生物技术有限公司测序。

表1 引物序列与扩增长度

2 结果与分析

2.1 细菌鉴定

分离株B1与B2的菌落微白、光滑、半透明。经革兰氏染色、镜检，均为革兰氏阴性菌。基于Vitek测定的46个生化反应结果，B1与B2均为凡隆气单胞菌，置信度达99%。

2.2 细菌对稚鳖的致病力

凡隆气单胞菌分离株B1与B2对稚鳖呈现相似的致死规律：108组在注射后4 h出现死亡，在24 h达死亡高峰，并在48 h内全部死亡；107组亦在注射后4 h出现死亡，在24～48 h出现死亡高峰，并在72 h内全部死亡；106组在注射后28 h出现死亡，并在24～96 h持续死亡，累积死亡个体占攻毒个体的50%～70%；105组仅有1只稚鳖死亡（表2）。剖检死亡个体的肝、肾，均分离得到与原注射菌菌落形态一致的细菌，并经Vitek判定为凡隆气单胞菌。基于修正的斯皮尔曼-卡伯分析方法，B1与B2的半数致死量（LD50）分别为6.17与6.05（表2）。

与上述死亡变化相符，106组稚鳖的肝脏细菌含量在24～48 h达到高峰（达105g-1），之后持续下降（图1）。综上所述，分离株B1与B2均对稚鳖具有较强的致病力。

图1 攻毒后稚鳖肝脏细菌含量测定

2.3 细菌毒力基因

分离得到的2株凡隆气单胞菌株均含有aerA，act，alt基因，而缺失ast（表3）。与其他4组已报道的鳖源气单胞菌比较，安徽与江苏分离株的aerA阳性率分别为83%与75%，其余3组则均为阳性；本研究与广西分离株的act阳性率均为100%；但广西分离株的alt阳性率为77%，而本研究与安徽分离株则均为100%；本研究的ast阳性率为0，其余4组鳖源气单胞菌则未检测该基因。由此可见，鳖源气单胞菌的aerA，act，alt阳性率较高；本研究分离株B1与B2的毒力基因型为aerA+act+alt+ast-，其aerA与alt阳性率高于其他组的平均水平。

表2 凡隆气单胞菌分离株B1与B2对稚鳖的毒力测定

表3 鳖源气单胞菌毒力基因型比较

3 小结

本研究从两批次浙江濒死中华鳖中分离得到2株凡隆气单胞菌B1与B2，所分离到的B1与B2菌株对稚鳖具有较强的毒力，其毒力基因型为aerA+act+alt+ast-。强致病性的凡隆气单胞菌对水生动物健康与水产品质量安全造成极大的隐患，亟需建立针对致病性气单胞菌的监测体系，以期为病害防控提供科学依据，保障中华鳖产业健康持续发展。

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（责任编辑：高 峻）

S 96

A

0528-9017（2014）06-0936-03

文献著录格式：孙波，江玲丽.鳖源凡隆气单胞菌分离株对稚鳖的致病力［J］.浙江农业科学，2014（6）：936-939.

2014-02-19

浙江省科技计划项目（2008C33049）

孙 波（1976-），男，浙江杭州人，研究方向为生物工程及水处理开发。E-mail：ppgsunbo@163.com。

江玲丽。E-mail：allan_523@163.com。