刘翠红 李红军

（章丘市中医医院病理科，山东 章丘 250200）

肿瘤的侵袭与转移是医学研究的热点之一。近些年来，随着科技的发展，人们生活水平的不断提高，但是，科技的发展造成环境的恶化，患胃肠癌的患者呈上升趋势，恶性肿瘤起病不明显，微小癌灶的浸润和转移难以及时探查和治疗，胃癌严重威胁人类健康和人的生命[1,2]。专家和学者不断加深对胃癌侵袭、转移分子机制的研究，nm23基因家族的成员之一—— nm23H1基因，作为一种重要的肿瘤转移抑制基因，nm23基因与胃癌关系的研究不断深入，阐明nm23H1基因遗传不稳定性与胃癌、结肠癌进展的关系，为临床治疗提供实验依据。对肿瘤浸润及转移的机制进行研究，关键是需要对可靠的预后指标和治疗靶点的精确建立[3]。在肿瘤进展和转移的研究中发现，肿瘤的浸润与转移主要源于肿瘤细胞内，随着抑癌蛋白的不断减少，对肿瘤细胞生长与转移的抑制能力，开始不断减弱并消失。P53、P16抑癌基因的失活造成了编码蛋白量的减少。在抑癌基因失活的机制研究中，发现基因的遗传不稳定性改变，即微卫星不稳定性（microsatellite instablility，MSI）和杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH），是基因突变，抑癌基因功能失调的主要原因，因此肿瘤得以生长。

1 组织标本与方法

人类某些恶性肿瘤如胃癌及结肠癌等均证实nm23H1基因表达与肿瘤转移或预后联系密切。但至今未见到其是否与胃肠癌的淋巴结转移和预后有关。胃肠癌在我国发生有上升的趋势，该病且具有淋巴转移早，预后不良的特点。

1.1 组织标本

标本来自我院外科2012年2月至2013年6月胃癌和结肠癌术后存档石蜡标本，不计术前行放疗或化疗的患者，共计35例。其中男性27例，女性8例，年龄22～75岁，平均47.9岁。肿瘤部位：胃癌20例，结肠癌15例。所有标本均再次复查、确诊，35例均为鳞状细胞癌，按WHO1971年标准病理分级：1、2、3级分别为16、10、9例，临床分期采用UICC1987年公布的标准：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分别为8、9、8、10例。手术采取切除根治术，术后经病理确诊有腹部淋巴结转移15例，占42.9%，术后失访2例，随访32例中，生存11个月以上30例，占93.8%，术后6个月内死亡2例，占6.2%。

1.2 方法

标本按4 μm厚连续切片，分别行nm23H1免疫组化染色及HE染色，免疫组化试剂盒，取米粒大小胃、肠组织，使用美国Maxim公司基因组DNA提取试剂盒，提取胃、肠组织基因组DNA，-20 ℃冰箱冻存，以说明书内容进行规范操作，以PBS代替一抗作阴性对照。参照王修海等的方法略有改进。取PCR扩增产物5 μL，加入等体积变性液（9.8 g/LCAS NO：75-12-7，10 mmol/L NaOH，20 mmol/L EDTA，0.5 g/LCAS NO：115-39-9，0.5 g/LCAS：2650-17-1），加入等体积的蔗糖溶液（100 g/L），混匀后98 ℃变性10 min；迅速置于-20 ℃冰箱10 min；全部上样于60 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳（丙烯酰胺∶N，N'甲叉双丙烯酰胺=29∶1），使用TBE工作液（0.5×）：45 mmol/L Tris-硼酸盐作为电泳缓冲液，它在应用前稀释，并用同一贮存液制备凝胶溶液和电泳缓冲液（pH8.0），恒压160 V，15 mA，室温电泳4 h，凝胶用5 g/L AgNO3染色，观察结果并照相记录。

1.3 结果测定

棕黄色颗粒为阳性信号，定位在癌细胞胞质中，随机选取5个高倍视野（×400）计数阳性细胞比例，阳性细胞＜30%，为低表达，定为阴性；阳性细胞≥30%为高表达，定为阳性。

1.4 SSCP统计分析

采用χ2检验。

2 结果

测定35例切片中，阳性率60%，有21例呈阳性表达。nm23H1基因在癌中的表达，即阳性产物主要位于胞质中，部分胞核、胞膜上亦有表达。

nm23H1表达与胃肠癌临床病理特征及预后的关系：经测定可见，nm23H1表达与患者性别、年龄及临床分期关系并无明显表示。但是，随胃肠癌病理分级的升高，nm23H1阳性率开始有降低的趋势，但P＞0.05，即差别并无统计学意义。在腹部淋巴结转移的胃肠癌组织中，nm23H1阳性率分别为52.97%和21.76%，P＜0.05存在显著差异。术后生存＞6个月组中nm23H1阳性率（56.27%）较＜6个月组（18.03%），高出很多，P＜0.05。

3 讨论

nm23H1基因早在20世纪80年代末由美国国立癌症研究所的STEEG等就克隆和鉴定出来了，主要来自小白鼠的不同转移潜能的恶性黑色素瘤细胞系K1735，其mRNA水平在低转移的癌细胞，比高转移癌细胞高10倍之多，将nm23基因导入高转移鼠黑色素癌细胞，可以大大降低了癌细胞的转移表型[4,5]。当前，nm23位基因缺失现象，普遍存在与人类的乳腺癌、肝癌、胃癌及结肠癌中，nm23等位基因的缺失与癌细胞的转移存在较密切的关系。世界各国经研究一致认为nm23基因是最具代表性的肿瘤转移抑制基因[6]。

原发性胃肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，目前有效的治疗方法并不明确，患者死亡的重要原因就是肿瘤细胞的转移。近年来通过分子克隆技术发现一类参与调控肿瘤转移的基因——转移抑制基因。这类基因的失活、突变或表达异常，可导致肿瘤的转移。经试验研究发现，转移抑制基因nm23基因与肿瘤转移的关系最紧密。nm23基因可以较明确地抑制肿瘤细胞转移潜能，但对nm23基因抑制肿瘤转移的机制，还需要进一步研究。临床研究发现，胃肠癌的发生和转移与nm23基因缺失或表达降低关系密切。对研究nm23H1基因在胃癌转移中的作用，主要通过免疫组织化学的方法检测nm23H1，已经发现了mRNA的表达及NDPK的变化，但对nm23H1基因突变的研究还在进行中。

[1]卢海英,张国强,李继承.中国人原发性胆囊肿瘤nm23H1基因遗传不稳定性的研究[J].分子细胞生物学报,2006,39(3):249-253.

[2]刘义春,王武.抑癌基因nm23H1与肿瘤转移的研究进展[J].中国现代医生,2010,48(22):12-13.

[3]康向东,张隆,吴蓉,等.阻抑素在胃肠癌中的表达情况及其临床意义[J].检验医学,2006,21(6):610-612.

[4]王轶淳,孙明军,傅宝玉.胃癌组织中β-catenin及nm23H1的表达及其临床意义[J].世界华人消化杂志,2007,15(19):2144-2147.

[5]朱大兴,周清华,王艳萍,等.利用定点突变技术构建突变nm23H1和EGFP融合基因[J].中国肺癌杂志,2006,9(2):117.

[6]Liu YB,Gao SL,Chen XP,et al.Expression and significance of heparanase and nm23H1 in hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2005,11(9):3392-3397.