黄诚胤，潘建华，李国泰

（重庆大学 体育学院，重庆400044）

疲劳对大脑功能的影响是神经科学领域研究的热点。目前大量研究证实，当人或动物处于疲劳状态时，其大脑学习、记忆功能可受到明显的影响［1，2］。研究表明茶叶中含有的儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）具有抗炎、抗肿瘤、调节免疫活性等作用［3，4］。同时 EGCG还是重要的天然抗氧化剂，它能透过血脑屏障，保护神经细胞免受运动后代谢产物的影响，具有改善疲劳对中枢神经系统影响的作用。本实验通过建立游泳运动训练的疲劳动物模型，采用Morris水迷宫实验和对新事物识别实验，探索EGCG对疲劳大鼠的空间学习能力与新事物探究能力的影响；采用PCR和Western blot分析了正常组、疲劳组及EGCG防护组，大鼠海马NMDA受体中NR1mRNA基因转录水平及蛋白水平的表达情况，探讨了EGCG对海马NMDA受体表达水平的影响以及与空间学习能力和新事物探究能力之间的关系，为日后研究EGCG改善大鼠对新事物探究能力和空间学习能力的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物建模及分组

1.1.1 动物饲养 本实验选取45只，SPF级健康SD雄性大鼠，体重（160±20）g左右，动物由第三军医大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK（渝）2007-0003）。实验大鼠随机分为3组（n＝15），4～5只／笼饲养。

1.1.2 动物分组及模型建立 实验分为正常对照组（A组）不施加游泳运动训练，饲养条件与疲劳模型组（B组）和EGCG防护组（C组）相同。动物适应性喂养一周后，对疲劳模型组（B组）和EGCG防护组（C组）动物进行3 d适应性游泳训练，每天1次，每次20 min。游泳训练在直径120 cm，宽50 cm，水深30 cm的容器中进行，水温（25±2）℃。疲劳模型采用无负重的游泳方式建立，当动物游至从身体轻度下沉，水淹到耳上、过眼、鼻尖，身体下沉无力，到连续3次没入水底，每次超过10 s视为力竭。出水后呼吸幅度深急、反应迟钝、俯卧或端坐，被握持时，四肢下垂。第一周每日游泳至力竭1次，第二周每日游泳至力竭2次，次间隔≥3 h［5］。EGCG保护组（C组）训练方案与疲劳模型组（B组）相同。

1.2 实验方法

1.2.1 给药方法 EGCG防护组（C组）按 EGCG 50 mg／（kg·d）容量灌胃，疲劳模型组（B组）与正常对照组（A组）按1 ml／（kg·d）生理盐水灌胃。每日在大鼠游泳后30 min给药，持续两周。

1.2.2 通过探索偏向实验新事物识别模型［6］让SD大鼠在长方形木箱（105 cm×75cm×30 cm）中适应性饲养2～3 d。在箱内两侧各放置一个物体，并记录下大鼠分别在不同物体上停留的时间。实验第1天，将大鼠熟悉的物体位置颠换，记录大鼠在新位置物体上停留时间及占总时间的比例，目的是将其结果作为判断大鼠对新事物探究能力的指标。

1.2.3 学习记忆功能的观察 Morris水迷宫直径120 cm，水深30 cm，平台高25 cm，平台直径10 cm；水温（25±2）℃，水中加入适量奶粉使水浑浊。将平台置于迷宫某一象限对角线中点处，在整个训练过程中平台位置保持不变。将大鼠依次从4个象限面向池壁放入池中，每次训练搜索时间60 s，大鼠找到平台后使之在平台上停留20 s，若未能在60 s找到平台则引导其爬上平台并停留20 s。每只大鼠每天连续接受8次定位航行实验训练，连续训练3 d。水迷宫训练结束后B组和C组动物开始接受两周疲劳训练。疲劳训练结束后24 h内，重复进行8次定向航行实验。在此期间正常对照组（A组）动物不接受任何处理，与疲劳模型组（B组）和EGCG防护组（C组）动物同步进行定向航行实验［7］。

1.2.4 标本的采集 采样前SD大鼠禁食12 h，采用腹腔内注射3%戊巴比妥钠（50 mg／kg体重）麻醉，心脏采血后，采血后立即取出脑组织，分离出海马，并用灭菌锡泊纸包裹后迅速储于液氮中。血样标本于室温静置2 h后，分离血清（3 000 r／min，离心 10 min），提取上清液与 1.5 ml EP管中分装标记，放置-70℃冰箱中保存。

1.2.5 PCR测定海马组织中NMDA受体NR1亚单位表达称取100 g海马组织，提取总RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA完整性。采用TakaRa公司反转录试剂盒将 RNA逆转录合成cDNA第一链。根据Genbank发布的NR1 cDNA基因序列设计引物，上游引物序列 Sense：5’-AAG GAG TGG AACGGA ATCAT-3’，下游引物序列 Anti-sense：5’-ACT TGA AGGGCT TGG AGA AC-3’，目的片段为 269 bp。内参基因GADPH片段大小为450 bp。扩增条件为：95℃预变性15 s；95℃变性10 s；54℃退火 20 s；68℃延伸30 s，共40个循环。1.2.6 海马组织中NMDA受体蛋白的表达 准确称取10 g海马组织，加入含PMSF的裂解液（按照1 ml裂解液加入10 μl PMSF），冰上静置30 min，用匀浆器研磨组织，整个过程需在冰上操作。收集研磨的组织悬液于1.5 ml EP管中离心5 min（12 000 r／min，4℃）后小心吸取上清液。采用 BCA试剂盒（BCA proteinassay reagent kit，美国 Pierce）进行蛋白测定定量。将所需蛋白样品加入的5×SDS蛋白上样缓冲液混匀，置于沸水浴中加热5～8 min，进行蛋白变性。以每孔上样量均为20μg总蛋白上样后，进行SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将分离的蛋白条带转移至PVDF膜上。转膜后用TBST缓冲液清洗2遍，加入封闭液37℃放置1 h。再分别加入单克隆抗体 anti—NR1（1∶100）和内参 anti—GADPH（1∶500），放置于4℃冰箱孵育过夜；以TBST洗膜3次，每次10 min；加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗（1∶5 000），37℃孵育1 h后，以TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。最后用ECL化学发光法显影试剂盒，显影，定影，室温下晾干。将胶片进行扫描后用胶图象处理系统分析目标带的分子量。

1.3 试剂与器材

EGCG标准品（美国Sigma公司）；戊巴比妥钠（成都科龙化工试剂厂）；0.01 mol／L PBS、（北京中杉金桥生物技术有限公司）；裂解液 RIPA（Radio-Immunop recip itation Assay，美国Pierce）；聚丙烯酰胺凝胶（Novex，San Diego，美国 CA）；NMDANR1及GAPDH引物合成（上海 Invitrogen公司）；Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司）；Morris水迷宫实验系统：北京现代太极电子有限公司；PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0软件包对实验数据进行统计学分析，实验数据均以均数±标准差表示，组间显著性差异比较采用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）和T-test。

2 结果

2.1 C组疲劳大鼠对新事物探究能力显著大于B组

探索偏向实验反应了大鼠在新事物上停留时间占总体时间的百分比。实验对三组动物的探索偏向数据进行组间比较，三组动物探索偏向分别为45%±4%（A组），46%±6%（B组）和43%±1%（C组），三者之间差异有显著性。在记忆保留过程中，A组动物的探索偏向为61%±6%，C组动物为56%±4%，B组为40%±3%，C组与B组间具有显著性差异（P＜0.01），与A组间差异无显著性。

2.2 水迷宫实验中C组动物寻找潜伏期显著短于B组动物

寻找潜伏期指动物进入水迷宫到找到平台的这段时间（用s来计算）。实验对三组动物寻找潜伏期的数据进行统计后发现在疲劳训练前三组动物寻找潜伏期无显著性差异。疲劳训练后第2天，B组和C组动物具有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01，表 1）。

Tab.1 Impacts of EGCGon fatigue rats through abilities of learning and memory（s，¯x±s，n＝8）

2.3 EGCG对运动疲劳大鼠海马组织中NMDA受体NR1亚单位表达的影响

通过PCR和Western blot测定NMDA受体NR1基因转录表达水平和蛋白表达水平。PCR结果分别成功扩增出了269 bp片段的 NR1基因和 450 bp片段的内参基因 GADPH。EGCG防护组（C组）中NR1基因的表达明显增加（图1）。同时通过Western blot检测到EGCG防护组（C组）中目的蛋白NR1的表达也明显增加（图2）。

Fig.1 RT-PCR demonstrated the presence of NR1 mRNA

Fig.2 Western blot demonstrated the presence of NR1 protein

3 讨论

运动性疲劳是指在运动过程中，机体的机能或工作效率不能维持在特定的水平而出现运动能力和身体功能暂时下降的现象［8］。随着竞技体育水平日益提高，运动员在训练过程中承受的心理压力和运动负荷增强，出现运动性疲劳的几率在逐渐增加。如果运动性疲劳不能及时得到恢复，不仅影响运动员的运动能力，同时也会影响其大脑学习记忆功能，以及在运动过程中的思维和判断能力。

N-甲基-D-门冬氨酸（NMDA）受体是中枢神经系统内一类重要的兴奋性氨基酸受体，属于离子型谷氨酸受体的一个亚型，由NR1与NR2亚单位组成。其中NMDA受体通道的必需组成组分是NR1，其表达量可以间接反应NMDA受体的总量。近年来，大量来源于生物化学、电生理和药理学等方面多项研究证明，海马NMDA受体与新事物探究能力和空间学习记忆有关［9］。EGCG是从绿茶中提取出的一种天然的儿茶素类物质，它易于通过血脑屏障达到脑组织中。有相关的研究报道，EGCG在海马学习记忆方面具有一定的功效。在快速老化鼠模型（SAMP 10）中，经EGCG处理后可以延缓脑老化、阻止脑萎缩、防止记忆衰退等功能［10］。急性施加EGCG到海马脑片上可使高频诱导的LTP幅度明显增加，而慢性喂食EGCG的大鼠或小鼠可以明显改善学习记忆能力。

为了降低实验操作本身引起的对动物的学习能力的影响，在这一模型中没有任何的规则，动物受到的训练比其他模型少。在疲劳运动训练前，三组动物新事物探究能力无显著性差异（数据未列出），说明三组动物对两个物体以及它们所处的位置的选择能力均衡。接受疲劳训练后，A组动物在新事物上停留时间与总时间之比为61%，C组动物为56%，B组为40%，说明在记忆保留过程中，EGCG可以改善疲劳动物对新事物的选择能力，帮助它们用较多的时间去探索新事物。海马中NMDA受体激活在动物对新事物探究中起着十分重要的作用。新近的研究发现NMDA依赖的突触可塑性可能是主体对新事物探究的生物学基础［11，12］。实验研究中我们发现，疲劳训练后B组动物海马NR1 mRNA的表达与C组相比有显著性差异（P＜0.05），提示EGCG可以显著改善疲劳动物NR1 mRNA的表达，提高动物对新事物探究能力。

空间学习记忆能力体现动物对整体环境的记忆，而Morris水迷宫正是利用动物的求生本能来达到这一目的。实验结果表明未接受疲劳训练前，三组间无显著性差异。而接受疲劳训练后C组和B组动物与A组相比具有显著性差异（P＜0.01），说明疲劳训练能够降低动物空间学习记忆能力；而B组动物寻找平台的时间明显长于C组动物，结果有显著性差异（P＜0.01），提示EGCG可在一定程度上改善疲劳带来的空间学习记忆能力减退，而EGCG可能是通过调节大脑海马NMDA受体表达而提高疲劳动物的空间学习记忆能力。

综上，疲劳运动可诱发大鼠Morris水迷宫中寻找潜伏期的时间增加，而通过EGCG保护后的实验组可明显缩短大鼠Morris水迷宫寻找潜伏期的时间，同时还可以增加海马神经组织中NMDA受体NR1亚单位的表达，并有效增强疲劳大鼠对新事物的探究及空间学习能力。

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