韩文志，宁 萌，黄景慧，刘 卫，张雁芳，崔文玉，汪 海

（军事医学科学院卫生学环境医学研究所心血管药物研究中心，北京100850）

在冷暴露过程中，机体通过释放去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、神经肽 Y（neuropeptide Y）等血管活性物质诱发体表及肢端血管发生收缩反应，减少外周供血，维持体心温度［1，2］。此类应激反应引起的血管收缩及血管内皮细胞冷损伤诱发形成的血栓是导致外周血液循环障碍和冷暴露过程中组织坏死的重要原因。因此，研究低温条件下血管活性变化，改善肢端血液循环，保护血管内皮避免低温损伤对于预防冻伤发生、提高人体耐寒能力具有重要意义［3］。

早期研究发现，妥拉苏林（tolazoline，Tol）合并山莨菪碱（anisodamine，Ani）能够发挥扩张末梢血管、改善微循环的作用，可以显著提高冷暴露条件下的人体肢端温度［4］。但由于Tol能够非特异性阻断突触前膜α2受体易引发心动过速、直立性低血压等不良反应［5］，经我室前期对现有临床常用特异性α1受体阻断药进行筛选比较，从哌唑嗪（prasozin，PZ）、特拉唑嗪（terazosin）、多沙唑嗪（doxazosin）中选取扩血管作用最强的PZ作为替代药物与Ani联合使用，并对其作用效果进行了进一步的药效评价。维生素E（Vitamin E，Vit E）作为氧自由基清除剂可用于对抗低温诱发局部组织缺氧引起的血管内皮损伤，自身对血管舒缩功能无明显影响［6］。上述药物作为临床用药已被广泛使用，但其在低温条件下血管组织水平的作用特征尚未见报道，本文通过观察冷暴露下的血管活性变化及上述药物在低温条件下对肢端血管活性的影响，为临床应用口服防冻效应药物提供体外实验基础。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

Vit E、乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）、苯肾上腺素（phenylephrine，PE）、硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）购自美国 Sigma公司；PZ购自日本 TCI公司。Krebs ringer液（mmol／L）：NaCl 118.0，KCl 4.7，CaCl22.5，KH2P041.2，NaHCO325.0，MgS041.2，EDTA 0.026，Glucose 11.1。

1.2 小鼠尾动脉血管环的制备

本实验采用雄性昆明小鼠，体重30～40 g，由军事医学科学院动物中心提供。将小鼠断颈处死后在鼠尾根部环切，扯下鼠尾的表面皮肤，分离尾腹侧面动脉血管，置于4℃的Krebs ringer液中，在镜下小心去除血管周围粘连的脂肪及结缔组织，剪成约2 mm的血管环。将血管环悬挂加有Krebs液的张力测定仪（DMT multi wire myograph system Model 610M）通道浴槽中，浴槽内液体温度依实验分组进行调整，持续通入95%O2＋5%CO2的混合气体，使用 Powerlab生物信号采集分析系统记录血管张力变化。调节血管张力预负荷至2 mN，每隔15 min换液1次，平衡1 h后，加入 80 mmol／L KCl收缩血管，重复三次，激发血管活性。以 PE（10-6mol／L）收缩血管待张力稳定后，累积加入待测药物记录血管张力变化情况。

1.3 血管收缩反应评价

选取活性良好的血管环，经KCl预收缩并洗脱处理，待张力值稳定后将其置于设定温度条件下。待达到设定温度时，累积加入 0.1、0.5、1、5、10、50 μmol／L的PE，记录血管张力变化情况。以血管张力值为纵坐标绘制浓度-效应曲线。

1.4 血管舒张反应评价

选取活性良好的血管环，经预处理后置于设定温度条件下，待血管张力值稳定后加入10-6mol／L PE（PZ组使用 30 mmol／L KCl）收缩血管，分别累积加入不同的扩血管药物，记录张力变化情况。以PE或KCl诱发的最大收缩为100%，以加人药物后的血管张力幅度与PE诱发最大收缩幅度之间的比值作为舒张率反映血管张力的变化。采用血管舒张率为纵坐标绘制浓度-效应曲线。

1.5 Vit E低温条件下对血管内皮依赖性舒张反应的影响

选取活性良好的血管环，分别加入Vit E至终浓度为 1μmol／L、10μmol／L，并将其置于 8℃低温条件下孵育。加入PE使血管收缩，待收缩稳定后累积加入 ACh（10-10～10-4mol／L），检测血管对 ACh的舒张反应，对比无Vit E添加时8℃和37℃时的血管舒张反应，评价血管内皮活性。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 不同温度条件下的血管舒缩功能变化特征

苯肾上腺素（phenylephrine，PE）能够特异性激活α1受体诱发血管收缩，在不同温度条件下依浓度梯度累积加入PE，低温条件下的血管张力变化与37℃时相比明显降低（P＜0.01，图 1A）。37℃、25℃、16℃、8℃下的血管最大收缩张力分别可达到（30.14±0.68）mN、（20.18±1.39）mN、（16.16±1.00）mN、（9.10±0.32）mN。表明血管收缩具有一定温度依赖性，随着温度的降低，血管收缩减弱。

SNP作为NO供体可以直接作用于血管平滑肌呈浓度依赖地诱发血管舒张，其作用不经过血管内皮细胞。不同温度条件下经相同浓度PE收缩的血管在SNP作用下的血管舒张存在显著差异（P＜0.01，图1B）。随着温度的降低，SNP作用下的血管最大舒张率增大，量效曲线明显左移，pD2依次为10.40±0.05、9.70±0.04、8.98±0.09、8.28±0.07。提示随着温度的降低，SNP作用下的血管舒张反应增强。

2.2 不同温度条件下 PZ、Ani扩血管作用变化特征

PZ为α1受体阻断剂，能够引起 KCl（30 mmol／L）预收缩的小鼠尾动脉环发生浓度依赖性舒张反应，与37℃条件下时相比，低温可明显提高PZ的扩张血管作用（P＜0.01，图 2A），其中 PZ为 10-11mol／L时两组的血管舒张率分别为（5.63±1.26）%和（35.12±3.14）%，PZ浓 度 为 10-5mol／L时 为（51.37±8.53）% 和（96.48±0.89）%。Ani为阿托品类的生物碱，主要通过阻断血管平滑肌细胞上的M1和M3受体发挥扩血管作用，但同时也有报道指出其作用具有一定内皮依赖性。低温同样能够增强Ani的扩血管作用（P＜0.01），其量效曲线存在明显左移（图2B），37℃和 8℃时相比 Emax分别为（74.88±1.76）%、（84.76±1.48）%，pD2分别为 9.77±0.06、9.49±0.06。提示上述两种药物在寒冷条件下对于肢端等低体温部位的血管扩张作用更强。

Fig.1 Effects of temperature on the vasoconstriction and vasodilatation in mice caudal arterial rings（¯x±s，n＝8）

2.3 不同温度条件下ACh扩血管作用变化特征

ACh可诱发PE预收缩内皮完整的血管环发生浓度依赖性舒张，降低外界温度可不同程度地抑制血管对 ACh的舒张反应。与 37℃组相比，25℃、16℃、8℃下血管舒张 Emax均显著降低（P＜0.01，图3），分别为（67.98±0.88）%、（56.73±0.92）%、（46.91±0.80）%、（46.29±0.67）%。结合 SNP不同温度条件下的舒血管作用特征，提示低温条件下ACh舒血管作用的减弱是由于内皮细胞功能受损引起，表明低温会引起血管内皮细胞损伤。

2.4 低温条件下Vit E的内皮保护作用

Fig.2 Effects of drugs on the relaxation in different temperature in mice caudal arterial rings（¯x±s，n＝8）

低温可造成血管内皮细胞活性降低，致使ACh内皮依赖的舒血管反应减弱。在Vit E存在的情况下，低温条件下ACh浓度依赖的舒血管反应较对照组出现明显改善，且10μmol／L的Vit E处理组血管舒张率高于 1μmol／L处理组（P＜0.01，图 4A），提示Vit E具有一定的内皮保护作用，且此作用在一定范围内具有剂量依赖性。

Fig.3 Effects of acetylcholine on the relaxation in different temperature in mice caudal arterial rings（¯x±s，n＝8）Ach：Acetylcholine

Fig.4 Effect of the addition of Vit Eduring the cold injury on endothelium-dependent relaxation in mice caudal arterial rings（¯x±s，n＝8）

3 讨论

血管内皮细胞被认为是对寒冷最敏感的部分，由于血管壁的损伤，血管壁的通透性增强，大量血管内液体和蛋白质外渗，形成渗出液和组织水肿，血液黏稠度大大增加，血流减慢，血液中有形成分堆积。加之血管壁受损后变粗糙，血管内皮细胞脱落，使胶原纤维暴露，容易使血小板黏着和聚集成为血栓。此外，为维持体心温度减少外周循环散热，机体发生应激反应促使外周血管收缩，导致外周组织缺氧、酸中毒及血液粘度的改变。该过程又进一步诱发PGF1α、TXA2等细胞活性物质的释放，加剧血管进一步收缩及血栓的形成［7］。当机体无法快速复温逆转上述改变时，会由于炎症的级联反应，加速冻伤发生发展过程，最终导致无法逆转的病理性损伤。因此，在短时间冷暴露情况下通过扩张外周血管、保护血管内皮细胞、改善微循环对于减轻或延缓上述病理过程、减少冻伤发生有着积极意义。

早期研究发现，Tol合并Ani在不增加热债、不降低体心温度的同时能够持续提高肢端温度，使肢端免于或延缓冻结［4］。其中Ani主要通过阻断血管平滑肌细胞上的M1和M3受体引起血管舒张，可以明显、快速缓解内脏平滑肌痉挛和血管痉挛，提高细胞对缺血缺氧的耐受［8］。本研究发现，低温能够明显降低血管收缩能力，低温条件下的血管更易于舒张，提示冷暴露引起的外周血管收缩更易于被药物所拮抗。PZ、Ani在较低温度下均表现出优于37℃条件下的扩血管作用，推测此类药物作为预防药物服用时对正常体温下的血液循环影响较小，当体表温度降低时能有效扩张外周血管，改善微循环。而PZ作为特异性α1受体阻断药用于替代Tol拮抗去甲肾上腺素的缩血管作用，在有效扩张外周血管的同时有利于减少因阻断α2受体所诱发的副反应。

Vit E是机体中重要的抗氧化剂，与生物膜中的磷脂有着特殊的亲和性，能够通过抑制活性氧簇离子的形成，预防或阻止其诱发的脂质过氧化反应，并以此保护细胞在低温条件下免受氧自由基的损伤［6］。本研究发现，低温会引起ACh内皮依赖的扩血管作用的减弱，提示血管内皮细胞对血管舒张的调节功能出现一定损伤。使用不同浓度Vit E孵育血管能够明显增强低温条件下血管内皮依赖的舒张作用，提示Vit E可以保护内皮避免低温损伤，且该作用在一定范围内具有剂量依赖性。Vit E在低温条件下对血管的内皮保护作用明显，可适当增加Vit E的摄入将有利于减少外周循环的内皮损伤，改善组织供血，减少冻伤发生。

综上所述，冷暴露过程中血管舒缩功能和内皮细胞的调节作用均有改变，血管收缩能力减弱，PZ、Ani此类具有直接平滑肌作用的扩血管药物在低温条件下的作用效果更强；同时Vit E在低温条件下具有良好的内皮保护作用，可以改善ACh内皮依赖的扩血管作用。外周供血不足和血管内皮细胞受损直接导致了冷损伤的发生发展，因此通过扩张外周血管、增强内皮细胞保护具有积极意义。此外，由于扩血管药物低温条件下的作用有所增强，也提示其作为预防药物出现时的良好应用前景。

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