李 浩，张苏丽，杨 艳，曾晓荣△，刘慧荣△

（1.首都医科大学生理学与病理生理学系，2.代谢紊乱相关心血管疾病北京市重点实验室，北京100069；3.泸州医学院心肌电生理研究室，四川泸州646000）

机体微血管对组织器官的血流供应以及血压的维持具有至关重要的作用［1］，微血管功能结构障碍也是高血压、冠心病、中风等心脑血管疾病发生发展的病变基础。因此，对微血管的检测是心脑血管疾病研究的一个重要方面。1972年Bevon［2］首次提出在离体条件下测量微血管张力的办法，此技术1976后被 Mulvaney和 Harper［3，4］等人进一步发展。目前，微血管环技术已覆盖肠系膜微动脉［5］、肺微动脉［6］、肾动脉血管［7］、大脑中动脉［8］等全身多脏器微血管。目前，关于微血管环技术在心脑血管疾病研究中应用的报导在逐年增多，但是由于微血管环技术操作步骤复杂精细，花费时间较长，不利于该技术的传播，且在国内对此技术在的应用并不普及［9］，很多学者对其操作过程不甚清楚，难以做出具有良好收缩、舒张活性的微血管环，而笔者发现对血管进行分离固定之后，在进行血管功能检测前，需对血管进行有效的刺激才可使血管活性充分激发。通过对微血管前负荷的标准化及高钾的刺激，可使血管具有良好的收缩舒张功能，提高了实验的成功率及稳定性，从而节省了时间和成本。本文拟以肠系膜三级动脉分支为例，介绍微血管环技术的具体操作及注意事项，在加入血管活性药物检验血管功能前给予血管充分的刺激以激活血管，让更多的学者了解和学习，并利用该技术开展研究。

1 材料与方法

1.1 试剂

HEPES液（mmol／L，NaCl 144，KCl 5.8，CaCl22.5，MgCl21.2，HEPES 5，葡萄糖 11.0；pH 7.4）、高钾液（mmol／L，NaCl 29.8，KCl 120，CaCl22.5，MgCl21.2，HEPES5，葡萄糖 11.0；pH 7.4）、重酒石酸去甲肾上腺素（norepinephrine，NE，禾丰，上海）、硝普钠（sodium nitroprusside，SNP，双鹤，北京）、乙酰胆碱（acetylcholine，ACh，Sigma，美国）。

1.2 仪器

Multi Myograph System-610M张力测定仪（Danish Myo Technology A／S公司，丹麦）、PowerLab数据采集分析系统、钢丝-40μm（ADInstruments，澳大利亚）、双目解剖显微镜、显微手术器械 、不锈钢金属丝剪刀（World Precision Instruments，美国）、有盖培养皿（注1／2硅酮树脂）、传感器定标工具箱。

1.3 实验动物

Wistar大鼠，雌雄不限。

1.4 实验方法

1.4.1 DMT（danish myo technology）定标 本操作的目的是对张力测定仪张力测定的校准，步骤如下：（1）张力测定仪中的肌动描计器含有一对独特的不锈钢钳夹，其中1个钳夹连接到一个螺旋测微器，用于调节脉管的周长。另一个钳夹连接到1个内置的高灵敏度张力传感器，用于测量脉管张力。在连接高灵敏度张力传感器的钳夹上固定一根钢丝，预热DMT装置，直到灌流液温度达到设定温度（37℃）。灌流液的高度至少盖住钳夹，严禁不加灌流液进行干加热。对DMT示数调零。（2）先把定标套件放到肌动描计器上方，定标套件的杠杆下的针放在钢丝与连接高灵敏度张力传感器的钳夹之间，不能碰到任何一方，开始DMT定标。先不加砝码，根据DMT屏幕上的提示加2 g砝码，2 g的砝码放在背离操作屏的一面，使钢丝受到向外的张力。定标前后各记录一段时间然后进行单位转换，无砝码时为0 mN，加入2 g砝码后为9.81 mN。

1.4.2 血管的游离 参考文献［10］的方法，将大鼠肠系膜浸入含有4℃已经通过氧气的HEPES液的平皿，平皿下方放置一冰袋，平皿内用大头针固定动脉主干和肠管。从一级或二级动脉开始用显微镊夹取脂肪，然后用显微剪沿血管走行方向将脂肪分离干净，将脂肪剔除后首先区分动静脉，静脉的分支比较圆顿成“U”型，而动脉分支较尖锐成“V”型，区别开后可将静脉减掉。血管分离干净后，选择带有二级和三级的血管分支，保留另一小段其它分支，以便血管的夹取，剪取血管环。

1.4.3 血管的固定 首先在肌动描记器内注入适量HEPES液体，用不锈钢金属丝剪刀剪取直径40 μm的钢丝，移动肌动扫描器内一侧的钳夹将钢丝夹住，一端用螺丝固定，另一端用于血管的穿入，注意用显微镊夹血管时不要夹需要测量的那段血管，防止血管弹性损坏，张力数据不准。尽量夹在穿血管时要剪掉的那段血管或是其他分支，血管穿入过程中要轻柔缓慢不要过度牵拉，尽量从血管中心穿入钢丝以防损伤内皮。穿入后固定钢丝另一端，将多余的血管减掉，留置2 mm的三级分支。然后将第二个钢丝缓慢插入血管，插入血管后钢丝两端固定。

1.4.4 血管的标准化 设置DMT标准化模块各项参数，打开 LabChart软件，选择 DMT-＞Normallization Settings，参数设置如下：Eyepiece calibration（mm／div）：0.36，Target pressure（kPa）：13.3（血管在正常生理状态处于100 mmHg［3］左右的压强下，这一参数可以根据研究组织的不同更改），IC1／IC100：0.9［10］，Online averaging time（seconds）：0，delay time（s）：120。再次打开 DMT菜单，选择 DMT-＞通道 1（2，3，4），显示a1、a2，其代表微血管在目镜下的起始刻度，填上之后会自动计算血管的长度；Wire diameter即金属丝的直径，一般选择40μm，也有25μm金属丝可选。将两根钢丝调整为平行零距离，固定血管漕漕温度恒定在37℃，平衡期每隔15 min用预热的HEPES液（37℃）更换浴漕内液体一次。血管环的张力变化通过DMT的换能系统采集，并用LabChart软件记录在电脑上。温育60 min后，每隔2 min通过逆时针旋转Myograph的螺旋测微尺逐步牵拉血管环，输入螺旋测微计读数并点击Add Point后，左下方会显示出螺旋测微计对应对数时组织的收缩张力Force及有效压强ERTP。当加入的点对应的ERTP大于设定的目标压强 13.3 kPa（100 mmHg）时，就不需要再加入点了。此时软件会自动算出要使血管处于标准化的内周长时，螺旋测微计的读数，即MicrometerX1。把螺旋测微计调到对应的读数MicrometerX1，就完成了组织张力的初始化。

1.4.5 血管的激活 （1）使用归零键使基线归零。在开始正式实验之前，用60 mmol／L的高钾溶液预收缩，连续两次，当相邻两次刺激的收缩幅度差别不大于10%，认为血管环组织结构完整，功能正常。（2）更换HEPES液，血管回到基线后平衡30 min以上。

1.4.6 血管舒张功能的检测 （1）内皮依赖性舒张功能的检测：向浴槽内加入终浓度为10-5mol／L的NE，待血管达到最大收缩值并稳定后，累计加入终浓度为10-9～10-5mol／L的ACh，注意加下一个舒张药的时机为上一次舒张变缓直至稳定之后。实验完毕后用正常HEPES液连续冲洗三遍，待血管张力恢复至基础状态并稳定30 min后，再开始下一轮实验。（2）非内皮依赖性舒张功能的检测：向浴槽内加入终浓度为10-5mol／L的NE，待血管达到最大收缩值并稳定后，累计加入终浓度为10-9～10-5mol／L的SNP，方法同上。

2 结果

2.1 血管标准化结果

如图1，通过标准化过程，可得到LabChart软件记录的微血管张力变化曲线，可见拉伸血管之后，血管张力急剧升高后稍微回落至张力稳定，即为处于此刻血管周长时的血管张力。通过LabChart软件中的DMT标准化模块，可自动计算出不同血管周长的收缩张力Force及有效压强ERTP，描绘出制横坐标为血管环内周长，纵坐标为单位长度血管环张力的指数曲线图（图2A），其中横坐标为血管内周长ICi＝205.6＋2Xi，纵坐标为单位长度血管环张力 Ti＝Fi／2L，图中直线图为 Pi＝2兀 Ti／ICi，其中 Pi（kPa）为设定的有效压强 13.3 kPa（100 mmHg），Ti（mN／mm）：单位长度血管环张力，ICi（μm）：血管环内周长，Fi（mN）：血管环总张力，可由 Myograph显示器得出，Xi（μm）：两根钢丝间的距离，可由 MyograPh螺旋测微尺读出，L（mm）：血管环长度，可用解剖纤维镜上的目镜测微尺测出。图2中曲线与直线的交点代表此时血管有效跨壁压为13.3 kPa，从而得出有效跨壁压为13.3 kPa时的血管环内周长IC100，及可使血管张力变化最敏感的血管环内周长IC1（IC1／IC100：0.9［10］），当加入的点对应的 ERTP大于设定的目标压强 13.3 kPa（100 mmHg）时，就不需要再加入点了。此时软件会自动算出要使组织处于标准化的内周长（IC1）时，螺旋测微计的读数，即 MicrometerX1（图2B）。

2.2 微血管对收缩药和舒张药物的反应曲线

加入10-5mol／L NE后，血管收缩，张力曲线升高，直至达到平台维持平衡，张力由3 mN升至19 mN，之后依次加入 10-9～10-5mol／L的 ACh或 SNP，血管张力成梯度降低，ACh和SNP引起的最大舒张率分别为80%和95%（图3）。

Fig.1 Response curve of microvascular tone in the process of microvascular normalization

Fig.2 Relationship between microvascular resting wall tension and internal circumference

Fig.3 Response curve of microvascular tone after given the vasoactive drugs

3 讨论

在正常生理条件下，血管内是充满血液的，因此血管壁处于一定的张力状态下。实验过程中血管内没有血液的压力，因此血管处于相对放松状态，这与正常的生理情况不相符。为了最大限度接近正常状态，需要给血管一定的初始张力以模拟血压。以往文章有给予微血管固定张力或给予血管固定周长，但由于微血管比较小，粗细变化比较大，不能像大血管环［11］一样给予固定前负荷，否则导致给予血管的有效压强参差不齐而不具有代表性，将导致实验数据的偏差，而本文通过DMT标准化模块可得出血管在一定压强下的最佳前负荷，通过微血管张力的标准化，获得离体组织最佳的实验条件，使血管跨壁压接近于正常生理状态，更好的模仿生理状态下血管功能变化，且使组织的张力变化对血管活性药物更加敏感，从而更好地观察。激活血管时，在高钾环境中，血管平滑肌去极化，导致血管收缩，是一种不涉及受体引起血管收缩的离子通道机制，因此能反映并激活血管最基本的收缩活性。本研究通过血管标准化确定微血管的最佳前负荷以及血管标准化和高钾环境对血管的不断刺激，可使血管活性充分激发，实验结果表明在加入血管活性药物后血管可出现明显的稳定的收缩舒张反应，具有较好的稳定性。微血管环技术不仅可用于各种模型血管功能的检测，同时在药理学等多方面展开用途。本文从基本的微血管张力功能检测入手展示微血管环的技术应用，技术困难之处在于血管的分离与固定，其操作精细，且需在解剖显微镜下操作，因此需要较长时间的练习才能做出活性较好的血管。另外如若不对微血管进行标准化或操作不清楚，随意给予微血管初始张力，导致给予血管的有效压强参差不齐而不具有代表性，将导致实验数据的偏差，而通过几次的练习，便可将微血管的标准化初步掌握。血管的收缩药和舒张药本实验以NE、ACh、SNP为代表，在操作中也可根据具体的实验设计更改，也可观察不同药物对血管的收缩或舒张反应。

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