杨慧娣，杨 铮，刘陶迪

（内蒙古医科大学基础医学院，呼和浩特010110）

海马和杏仁核是大脑边缘系统独立的而又相互联系的两个部位，大脑边缘系统被认为是调节记忆的重要部位。来自两个记忆系统的这两个结构可以根据处理信息的不同，而又存在功能性的区分。在啮齿动物中，海马区是调节非自我学习的重要脑区，非自我学习与独立的线索和位置有关；而杏仁核是联接不同环境线索和生物刺激（例如食物和损伤等）的重要脑区［1］。损伤杏仁核或者海马任意一个脑区有时能增加另外一个脑区处理记忆进程的能力。这暗示这两个脑区大部分是独立的，它们一些重叠的部位具有竞争特征。然而，在重叠区，这两个脑区可能是相互合作的。特别是，增加杏仁核的活性与增强的海马独立调节的空间记忆有关［2］。

伏隔核（nucleus accumbens，NAcc）是边缘系统和运动的交互点，伏隔核将动机行为转变为目标导向行为。神经生理学和神经解剖学的研究已经揭示了可能的神经机制，伏隔核及伏隔核内的多巴胺神经元（dopamine，DA）的分支选择和整合边缘和皮质的神经投射，而这些神经可以调控行为。研究发现伏隔核的壳通过空间／背景信息调控奖赏和药物成瘾行为。伏隔核的核通过独立的线索调控各种的行为。基底核的多巴胺在调节学习行为方面起到关键作用，然而，大脑边缘系统中的多巴胺神经元是否调节与学习记忆相关的行为还不清楚［3］。本研究的目的是测试大脑边缘系统的多巴胺神经元是否调控记忆行为。我们假设多巴胺的激动剂阿朴吗啡能减轻东莨宕碱诱导的小鼠记忆障碍。本实验用东莨菪碱诱导小鼠的记忆障碍，为了研究多巴胺神经元对记忆的作用，检测腹腔注射多巴胺的激动剂阿朴吗啡后对小鼠的记忆的影响。我们使用即刻早期基因Fos蛋白标记细胞活性，酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH；多巴胺转化的限速酶）标记多巴胺神经元，共表达Fos／TH细胞表示有活性的多巴胺细胞，使用免疫组织化学的方法研究脑组织各区的多巴胺细胞的活性。

1 材料与方法

1.1 实验动物与饲养

雄性昆明小鼠，体重20 g，内蒙古大学实验动物中心提供，清洁级。单笼饲养，饲料为普通饲料，自由摄食饮水。每日更换饮水和饲料，保持动物生活环境通风及清洁卫生。动物房内温度为（22±1）℃，光照时间为每日 8∶00～20∶00。

1.2 实验设计和方法

1.2.1 东莨菪碱诱导的记忆障碍与多巴胺神经元的关系 30只雄性小鼠随机分成3组（n＝10），注射生理盐水组（对照组：NS组），腹腔注射氢溴酸东莨菪碱溶液 0.3 mg／kg（SCOP 0.3）和 3.0 mg／kg（SCOP 3.0），连续注射 60 d。注射药物的第 53天和第60天测定避暗行为。第60天测定行为结束后，将动物麻醉后灌注取脑做免疫组化。

1.2.2 多巴胺激动剂阿朴吗啡与东莨菪碱诱导的小鼠记忆障碍 40只雄性小鼠随机分成4组（n＝10），腹腔注射东莨菪碱 3.0 mg／kg，连续注射 60 d。注射药物的第53天和第60天测定避暗行为，确定造模成功后，一组注射100μl的生理盐水（NS），另三组分别注射 100μl的阿朴吗啡 0.1 mg／kg（APO 0.1）、0.5 mg／kg（APO 0.5）和 2.0 mg／kg（APO 2.0，n＝10）。连续给药30 d，在注射阿朴吗啡第23天和30天测定记忆行为。第30天行为测定后将动物麻醉后灌注取脑做免疫组化。

1.2.3 小鼠记忆行为检测 避暗箱由控制器（明室）和活动箱（暗室）两部分组成，由门洞相连。测试和记录小鼠第一次从明室进入暗室的潜伏期和受到电击的错误次数。实验时将小鼠头部背对着洞口放入明室，打开门洞，实验时间开始倒计时。若某室的小鼠从明室进入暗室中，则潜伏期计时停止，同时在暗室内施与36 V的电刺激，此时所显示的值即为该小鼠的潜伏期，错误次数显示值为1。小鼠在暗室中受到电击后逃出，错误次数加1。在注射药物的第53天，对小鼠进行训练，记录小鼠的潜伏期（latency）和 5 min内的错误次数（number of mistaken），并在7 d后（即第60天）进行测试，同样记录小鼠的潜伏期和5 min内的错误次数。如果5 min时小鼠仍未进入暗室，错误次数记为0次，潜伏期记为300 s。

1.2.4 多巴胺神经元 （DA）表达的检测：免疫组织化学法 实验动物以10 g／L戊巴比妥钠腹腔麻醉（40 mg／kg），经左心室向升主动脉匀速灌注 37℃生理盐水和4%多聚甲醛的磷酸缓冲液（pH 7.2，0.1 mol／L）。将脑移入多聚甲醛中固定4 h。移入含30%蔗糖的磷酸缓冲液中，4℃过夜。-20℃冰冻连续切片（冠状切片），片厚20μm。间隔80μm的切片用以前已经建立的方法做c-Fos和TH的免疫组化［1］。简短地说，切片在 1%硼氢化钠中孵育 20 min，10%山羊血清1 h。切片在兔抗c-Fos抗体 （c-Fos［4］-G：sc-52；1∶8 000；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）4℃孵育 24 h。之后，切片在生物素化的羊抗兔 IgG（BA-1000；1∶300；Vector，Burlingame，CA）室温孵育2 h，抗生物素蛋白-生物素复合物（Vectastain Elite，Vector，Burlingame，CA）室温 90 min，DAB（加入镍粉）显色。之后，切片在兔抗-TH（AB152；1∶8 000；Chemicon，Temecula，CA）室温过夜，切片在生物素化的羊抗兔 IgG（BA-1000；1∶300；Vector，Burlingame，CA）室温孵育 2 h，抗生物素蛋白-生物素复合物 （Vectastain Elite，Vector；Burlingame，CA）室温90 min，DAB显色。

1.2.5 图像分析及统计学处理 每只小鼠各取3张不同断面切片。并用imagine-pro-plus 6.0分析软件在各脑区随意选取三个视野，测量DA阳性神经元胞体个数（反映DA相对含量）。计算每组切片单位面积内DA阳性神经元数目（平均密度）。

1.3 统计方法

采用 SPSS 17.0软件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）进行数据分析。在统计分析前，所有数据用Kolmogorov-Smirnov和Levene分别进行正态性和方差齐性检验。所有实验数据组间差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）；其中实验 1的 Fos-ir，TH-ir和TH／Fos细胞的组间差异采用 t检验。结果用均数 ±标准差表示。

2 结果

2.1 东莨菪碱对小鼠记忆的影响。

2.1.1 记忆行为 注射东莨菪碱明显导致小鼠记忆受损。在测试记忆时（第 53天），SCOP 0.3、SCOP 3.0组和 NS组潜伏期（P＞0.05）和错误次数（P＞0.05）均无显著差异；注射的第60天，注射东莨菪碱3.0 mg／kg组（SCOP 3.0）的潜伏期比 NS组显著缩短，仅是 NS组的 1／4（P＜0.05），东莨菪碱 SCOP 3.0组错误次数比 NS组增加了大约 4倍（P＜0.05）。而注射东莨菪碱 SCOP 0.3mg／kg对小鼠记忆没有作用（表1）。

Tab.1 Effect of different dose of scopolamine on dark avoidance behavior in mice（¯x±s，n＝10）

2.1.2 脑中 Fos-ir和 TH-ir免疫阳性反应 因为SCOP 0.3和 NS组记忆没有差异，所以我们只将SCOP 3.0组动物处死后做脑组织的免疫组化研究。在伏隔核和海马区的CA1和CA3的Fos-ir细胞数明显减少（P＜0.01），暗示海马区 CA1和 CA3区的活性被抑制。而且与NS组相比，腹侧被盖区的TH-ir（P＜0.01）细胞减少了 38.3%，表明多巴胺神经细胞减少；TH／Fos-ir（P＜0.01）细胞减少了 48.6%，暗示有功能的多巴胺神经元减少。然而，外侧下丘脑的Fos-ir细胞数、和室旁核的 TH-ir、TH／Fos-ir细胞和Fos-ir细胞均没有检测到差异（P＞0.05，表 2，图 1）。

Tab.2 Scopolamine treatment decreased number of Fos-ir，TH-ir and Fos／TH-ir cells compared with saline treatment in mice（¯x±s，n＝10）

Fig.1 Photomicrographs displaying cells labeled for Fos-ir（blackunctuate nuclear staining）or TH in the NAcc or VTA（A）PVN or LH（B），CA1 and CA3（C）

2.2 多巴胺激动剂阿朴吗啡对东莨菪碱诱导的小鼠记忆的影响。

注射阿朴吗啡明显减轻了东莨菪碱诱导的记忆障碍。除了注射0.1 mg／kg对小鼠的记忆没有任何作用外，注射 0.5 mg／kg和 2.0 mg／kg剂量均减轻了东莨菪碱诱导的记忆障碍（P＜0.05）。与NS组相比，错误次数分别减少了65.5%和75.0%；而潜伏期分别增加了1.5倍和1.44倍。且没有剂量依赖性（P＞0.05，表 3）。

因为APO 0.5和APO 2.0组没有差异所以合并为一组，做免疫组化。注射阿朴吗啡后，小鼠伏隔核和海马CA1区的活性明显增加，具体表现为与NS组相比，伏隔核的 Fos-ir细胞数（P＜0.05）增加了69.6%，海马的 CA1区 Fos-ir细胞数（P＜0.05）增加了40.9%；腹侧被盖区的TH／Fos-ir共表达的细胞数（P＜0.05）比 NS组增加了46.2%，表明有功能的多巴胺神经元增加了。同时，室旁核的Fos-ir、TH-ir和TH／Fos-ir细胞和外侧下丘脑的Fos-ir细胞没有任何差异（表 4，图 2）。

Tab.3 Effect of different dose apomorphine on Scopolamine-induced memory deficit in mice（¯x±s，n＝10）

Tab.4 Apomorphine treatment increased number of Fos-ir，TH-ir and Fos／TH-ir cells compared with saline treatment in scopolamine-induced memory deficit mice（¯x±s，n＝10）

3 讨论

本研究结果表明东莨菪碱导致小鼠记忆障碍，注射东蒗宕碱的小鼠错误次数比对照组增加了大约4倍，潜伏期的时间则缩短了大约1／4，伏隔核和海马区的CA1和CA3的Fos-ir细胞数减少，说明海马区的东莨菪碱抑制小鼠海马CA1和CA3区的活性，与Eldred等的报道一致［2-4］。同时，东蒗宕碱导致腹侧被盖区的TH-ir和TH／Fos-ir共表达细胞显著减少，暗示多巴胺神经元的减少与记忆有关。注射多巴胺激动剂阿朴吗啡后明显减轻了东莨菪碱诱导的小鼠记忆障碍，表现为潜伏期增加、错误次数减少；伏隔核和海马CA1区活性增加，腹侧被盖区TH／Fos-ir共表达的细胞增多，表明多巴胺神经元被激活。这些数据表明中脑多巴胺神经元与东莨宕碱诱导的小鼠记忆障碍有关。

Fig.2 Photomicrographs displaying cells labeled for Fos-ir（blackunctuate nuclear staining）or TH in the NAcc or VTA（A），PVN or LH（B），CA1 and CA3（C）

中脑多巴胺系统控制许多行为［5，6］，例如奖赏行为、成瘾和学习行为。研究发现精神兴奋类药物和大多数成瘾药物均能增强多巴胺信号，从而增强调控学习行为的多巴胺进程［7］。研究发现反复暴露在精神兴奋类药物，例如氟哌丁苯，会导致腹侧被盖区的多巴胺神经元的改变和伏隔核多巴胺突触后膜的变化，这些改变会持续几周或者几个月［8，9］。本实验发现东莨菪碱诱导的小鼠记忆障碍后不仅降低了腹侧被盖区多巴胺神经元的数量（TH-ir细胞数）和活性（TH／Fos-ir共表达的细胞数），也降低伏隔核和海马区的活性（Fos-ir细胞数），暗示多巴胺数量和活性的减少与小鼠的记忆障碍有密切的关系。而注射成瘾药物多巴胺激动剂阿朴吗啡后减轻了小鼠的记忆障碍，表现为进洞的潜伏期增加、错误次数减少。而且注射阿朴吗啡后尽管没有增加多巴胺神经元的数量，但是腹侧被盖区TH／Fos-ir共表达的细胞数明显增多，说明激活中脑多巴胺神经元明显增加小鼠的记忆。证实了我们的假设即多巴胺神经元的激活可以增加小鼠的记忆。但是本研究仅仅发现了中脑多巴胺神经元与东莨菪碱诱导的小鼠记忆有关，还不能直接证明腹侧被盖区的多巴胺神经元直接调节小鼠的记忆。因此，下一步的研究将直接损伤腹侧被盖区的多巴胺神经元，验证多巴胺神经元调节记忆的作用。

总之，本研究证明了多巴胺受体激动剂阿朴吗啡可以缓解东莨菪碱诱导的小鼠记忆障碍。东莨菪碱抑制小鼠海马CA1和CA3区的活性。同时，东莨菪碱不仅导致被盖腹侧区的多巴胺神经元减少而且也抑制了该区多巴胺神经元的活性。而多巴胺受体激动剂阿朴吗啡则通过激活海马CA1区和伏隔核及腹侧被盖区多巴胺神经元来缓解东莨菪碱诱导的小鼠记忆障碍。本研究将进一步了解调节记忆的机制，为治疗与记忆相关的疾病探讨新的新方法提供理论依据。

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