陈海娥，马迎春，何金波，黄林静，陈 丹，应 磊，王万铁

（温州医科大学缺血-再灌注损伤研究所病理生理学教研室，浙江温州325035）

肺缺血／再灌注损伤（lung ischemia reperfusion injury，LIRI）可在多种临床情况下发生，包括心肺转流，肺溶栓治疗与肺移植等。近年来随着心胸外科手术的广泛开展，肺缺血／再灌注损伤的问题渐受重视。在再灌注早期进行的一系列快速的血流中断／再通的过程，其可以改变再灌注血流动力学并对缺血再灌注器官产生保护作用这叫做缺血后处理（ischemic postconditioning，IPO），是近年发现的一种重要内源性保护机制。已有研究表明IPO对肺I／R有明显的保护作用，但其机制仍不清楚［1］。

丝裂原活化蛋白激酶（motigen-activated protein kinases，MAPKs）家族是体内一条重要的信号转导通路，他们在调节细胞内代谢、基因表达、疾病、凋亡和外界刺激的应答中有重要的作用。P38MAPK是其家族中重要的一个成员，目前已有很多实验发现了其在心、肝、脑IPO中的重要作用［2-4］，但对于其在肺IPO中的作用还未探明，本研究旨在探讨其在大鼠肺IPO中的作用，以期为临床减轻肺缺血再灌注损伤提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

SB203580（货号 S8307，美国 Sigma公司），原位细胞凋亡检测试剂盒（LOT：13033000，德国Roche公司），Trizol提取液（美国 Life technologies公司），逆转录试剂盒（美国Fermentas Life Science公司），PCR试剂盒（美国Fermentas Life Science公司）；Bcl-2鼠多克隆抗体（美国santa cruz公司）；Bax鼠多克隆抗体（美国santa cruz公司）；即用型SABC过氧化物酶试剂盒（武汉博士德公司）；DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物科技有限公司），脱氧核糖核酸酶Ⅰ（美国Sigma公司），其余均为市售分析纯。

1.2 实验动物与分组

SPF级 SD大鼠40只，雄性，体重200～250 g。饲养于SPF级环境中，由上海斯莱克动物实验中心提供（实验动物使用许可证号：SCXK（沪）2012-0002），动物实验方案经温州医学院实验动物伦理委员会审核并同意实施。随机将实验动物分为5组（每组 8只）：对照组（C组），缺血／再灌注组（I／R组），缺血／再灌注组＋缺血后处理组（IPO组），缺血后处理＋0.4%DMSO的PBS溶液对照组（D组），缺血后处理 ＋SB203580组（SB组）。SB203580为P38MAPK的特异性抑制剂，用药剂量为1 mg／kg体重，将 1 mg SB203580溶于7.5 ml 0.4%DMSO的PBS溶液中，使其充分溶解，根据文献［5］可知SB203580发挥药效的时间为注射后30～45 min，这样我们只有在缺血30 min前尾静脉注射入大鼠体内才能保证在IPO时其已发挥对P38MAPK的抑制作用。各组实验结束后留取左肺组织标本。

1.3 动物模型复制

按照已发表文献报道的方法复制大鼠原位肺缺血／再灌注和缺血后处理动物模型［1］。大鼠称重后，按8 ml／kg体重20%乌拉坦腹腔注射麻醉。麻醉后气管插管，连接小动物呼吸机，行机械通气，呼吸机参数设置为：潮气量 7～8 ml／kg，呼吸频率 70 b／min，吸呼比3∶2。消毒左胸部皮肤，分离筋膜和肌肉，断开第3、4根肋骨，打开胸腔，暴露左肺，游离左肺门，动脉夹夹闭30 min，即为缺血期，松开动脉夹，即为再灌注期，再灌注时间为2 h，如此即成功复制在体原位单肺缺血／再灌注模型；再灌注前给予连续的缺血30 s／再灌注30 s的处理共3次，结束后再灌注2 h，即为缺血后处理组。C组游离左肺门后不夹闭肺门，观察 2.5 h。

1.4 观察指标

1.4.1 肺湿干重比（wet weight／dry weight，W／D）和总肺含水量（total lung water content，TLW）检测 实验结束后，处死动物并留取左肺约2 g组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸去多余水分后称重，即为湿重（wet weight，W）；在 70℃恒温烤箱内烘烤 24 h，烘干后再称重，直至重量不再变化，即为干重（dry weight，D），故肺组织湿／干重比（wet weight／dry weight，W／D）＝W÷D。总肺水含量（total lung water content，TLW）的计算公式如下：TLW＝（W-D）÷D。

1.4.2 肺组织光镜检测及肺泡损伤数定量评价指标（index of quantitave assessment，IQA）检测 各组实验结束后，处死动物，取左肺下叶约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小肺组织，生理盐水冲洗干净，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，常规行石蜡包埋，切片，HE法染色，于普通光学显微镜下观察各组标本组织形态学改变。在200倍视野下随机连续观察50个视野，计数每个视野下的总肺泡数及损伤肺泡数。肺泡内含红细胞和或白细胞超过2个以上或肺泡内含有水肿渗出液的均视为损伤肺泡。把损伤肺泡数占总计肺泡数百分比的值作为IQA（%）。

1.4.3 原位末端标记（TUNEL）法检测 依据Roche公司提供的试剂盒说明书所述方法进行操作。凋亡细胞胞核经DAB染色呈棕褐色，未凋亡细胞胞核复染后呈蓝紫色。计数5个高倍镜（×400）下的凋亡细胞数。每张片子至少观察500个细胞，计算每100个细胞内的阳性细胞，即凋亡指数（apoptotic index，AI）。

1.4.4 RT-PCR法测定肺组织 Bax、Bcl-2基因的表达 Trizol法提取肺组织总RNA。测定总RNA浓度。按照逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA。再按照PCR试剂盒说明书进行cDNA扩增。内参及各目的基因的序列如下表1。PCR反应条件为：起始变性，94℃，3 min；变性，94℃，30 s；退火，55℃（βactin和 Bax）／61.6℃（Bcl-2），30 s；延伸，72℃，1 min；终止延伸，72℃，5 min。循环数β-actin和Bax 30次，Bcl-2 33次。各目的基因扩增产物片段长度为：βactin：378 bp；Bax：337 bp；Bcl-2：411 bp。用各基因扩增产物的密度与β-actin基因扩增产物的密度比值表示各基因表达水平。

Tab.1Sequences of the primers

1.4.5 免疫组化法检测标本中Bax、Bcl-2蛋白的表达水平及其定位 按照试剂盒所提供的说明书和文献［6］所述步骤进行操作。标本上呈棕褐色的部分为Bcl-2、Bax蛋白阳性表达。采用美国 IPP6.0（Image-pro plus）彩色图像分析系统测定阳性部位及背景的光密度值，以阳性部位的光密度值减背景的光密度值代表阳性部位的吸光度（optical density，OD）值。

1.4.6 统计学处理 计量资料均进行正态性检验，以均数±标准差形式表示，采用 SPSS 17.0软件，多组样本均数比较进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），方差齐性者两两比较采用LSD法，方差不齐者进行Dunnet’s t检验。双变量相关性分析，采用Bivariate过程的Pearson相关分析法。

2 结果

2.1 肺组织湿／干重比 （W／D）和总肺含水量（TLW）的变化

与C组相比，I／R组 W／D和 TLW均明显升高（P＜0.01），IPO组、D组、SB组与 I／R组相比，W／D和TLW均明显降低（P＜0.05，P＜0.01），IPO组与D组相比没有统计学意义（P＞0.05），SB组与 IPO组相比，W／D和 TLW均明显降低（P＜0.01，表 2）。

Tab.2 W／D、TLW、IQA、AI in lung tissues of different groups（¯x±s，n＝8）

2.2 光镜下肺组织形态学的变化及肺泡损伤数定量评估（IQA）

与 C组相比，I／R组 IQA显著升高（P＜0.01）；IPO组、D组、SB组与 I／R组相比，IQA显著降低（P＜0.01）；IPO组与D组相比，IQA差异没有统计学意义（P＞0.05）；SB组与 IPO组相比，IQA显著降低（P＜0.01，表2）。光镜下，C组肺间质及肺泡结构保持完整，无受损，未见炎性细胞及红细胞浸润；I／R组可见肺间质增宽水肿，炎症细胞浸润，肺泡内可见较多红细胞渗出，偶可见肺部实性变，损伤明显；IPO组与D组肺泡损伤较I／R组稍减轻，视野下可见完整肺泡，炎性细胞及红细胞浸润量少；SB组肺泡结构相对完整，肺泡间质水肿不明显，少量红细胞及炎性细胞浸润（图1）。

Fig.1 Structure of the left lung in each group under microscope（HE×200）

2.3 各组细胞凋亡情况及AI值的变化

与 C组相比，I／R组凋亡指数（35.650±0.762）显著升高，D组（25.738±0.944）、SB组（20.850±0.961）、IPO组 AI（26.263±0.952）显著低于 I／R组（均 P＜0.01），D组与 IPO组相比无明显差异（P＞0.05），SB组显著低于 IPO组（P＜0.01，表2）。凋亡细胞主要为肺泡上皮细胞与血管内皮细胞（图2）。

Fig.2 Apoptotic cells in lung tissue of each group（DAB×400）A：Cgroup（control group）；B：I／R group（ischemia／reperfusion group）；C：IPOgroup（ischemic postconditioning group）；D：D group（dimethyl sulfoxide group）； E： SB group（SB203580 group）

2.4 肺组织Bax、Bcl-2基因表达水平的变化

在C组Bcl-2呈高水平表达、Bax表达不明显，I／R组较C组Bcl-2表达明显下降、Bax明显上调，同时 Bcl-2／Bax的比值降低（P均 ＜0.01）；与 I／R组比较，D组、SB组、IPO组 Bcl-2 mRNA表达增强，Bax mRNA表达减弱，Bcl-2／Bax的比值增高（均 P＜0.01），D组与 IPO组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；SB组 IPO组比较，Bcl-2表达上调、Bax表达下降，二者比值升高（P＜0.05，P＜0.01，表 3、图3）。

Tab.3 Relative amout of Bcl-2、Bax mRNA and ratio of Bcl-2／Bax mRNA in lung tissue in each group（¯x±s，n＝8）

Fig.3 RT-PCR electrophoresis strip of Bcl-2 and Bax in lung tissue of each group

2.5 肺组织 Bax、Bcl-2蛋白的表达水平的变化及定位

在C组Bcl-2呈高水平表达、Bax表达不明显，I／R组表达较C组Bcl-2表达明显下降、Bax明显上调，同时 Bcl-2／Bax的比值降低（均 P＜0.01）；与 I／R组比较，D组、SB组、IPO组Bcl-2蛋白表达增强，Bax表达减弱，Bcl-2／Bax的比值增高（均 P＜0.01）；D组IPO组相比无明显差异（P＞0.05）；SB组Bcl-2表达较IPO组明显增高、Bax表达明显降低，二者比值增高（均 P＜0.01，表 4），Bcl-2、Bax蛋白阳性表达部位主要是支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞的胞浆（图4、图5）。

Tab.4 Optical density of Bcl-2、Bax of lung tissues in different groups and ratio of Bcl-2／Bax protein（¯x±s，n＝8）

Fig.4 Expression of Bcl-2 protein in lung tissue of each group（immunohistochemistry DAB×200）

Fig.5 Expression of Bax protein in lung tissue of each group（immunohistochemistry DAB×200）

2.6 相关性分析

肺组织 AI与肺组织 W／D、TLW、IQA、Bax基因及蛋白表达之间呈正相关（r分别为0.870，0.870，0.953，0.908，0.963，均 P＜0.01，n＝40）；肺组织 AI与肺组织Bcl-2基因及蛋白、Bcl-2／Bax基因及蛋白呈负相关（r分别为-0.858，-0.922，-0.941，-0.980，P均 ＜0.01，n＝40）。

3 讨论

自从2003年Zhao等［7］成功的在犬心肌梗死模型上证实IPO可明显缩小心肌梗死面积并且其保护作用与预处理相当之后，许多国内外学者对IPO进行了一系列从其是否有保护作用到其作用机制的研究，并逐步证实IPO在多种实验动物的心、肝、脑等器官具有保护作用［2-4］。目前其保护机制还不十分清楚。本实验通过测量肺组织损伤程度的敏感指标W／D、TLW、IQA显示，IPO成功的减轻了肺 I／R所造成的肺组织损伤；而AI值则是细胞凋亡的指标，其在各个组的变化表明，IPO能减轻肺细胞凋亡，根据相关性分析得知AI与W／D、TLW、IQA呈显著正相关，这表明细胞凋亡参与肺I／R损伤的发生。许多研究表明Bcl-2基因家族参与细胞凋亡的调控，其调控机制主要是由于Bcl-2／Bax基因的相互作用，其中Bcl-2的作用是抑制细胞凋亡，Bax的作用是促进细胞凋亡，细胞存亡与否由二者之比所决定，Bcl-2占优势时细胞存活，Bax占优势时细胞走向凋亡［8］。本研究通过检测各组Bcl-2、Bax基因及蛋白的表达，进一步证实各组中细胞凋亡情况。结果证实IPO上调Bcl-2，下调Bax基因和蛋白，从而减轻细胞凋亡。

p38MAPK是1993年发现的MAPK家族的又一重要成员 p38MAPK可被应激刺激、肿瘤坏死因子a、白细胞介素1、成纤维细胞生长因子、脂多糖和革兰氏阳性细菌细胞壁成分激活［9］。因此，又称为MAPK应激信号通路。本实验室已通过实验证明p38MAPK在肺I／R中被激活而使肺组织损伤和肺细胞凋亡加重［6］。很多实验也证实其在IPO中具有重要作用，但其在各个器官中所起的作用并不完全一致，这可能和其在各个器官中的亚型不同有关。

本文主要是通过应用P38MAPK的抑制剂SB203580来说明其在IPO中的作用，这是基于本实验室以前的已经证明P38MAPK在I／R中的作用这一结果上来开展的，本室先前的实验通过I／R时应用SB203580证实：I／R时可以通过应用SB203580来抑制P38MAPK从而产生保护作用，也就是说I／R很可能是通过激活P38MAPK来对缺血器官造成损伤的［6］。基于这一事实，我们继续应用SB203580这一P38MAPK的特异性抑制剂来干预IPO，来证明IPO是通过抑制P38MAPK对I／R器官产生保护作用的。从实验结果来看，应用SB203580之后肺IPO减轻肺组织损伤和细胞凋亡的作用更加明显，这说明可能是通过抑制p38MAPK的活化来产生对肺I／R损伤的保护作用的。并且已有文献表明，p38MAPK激活可以使抑制凋亡蛋白Bcl-2发生磷酸化改变，使线粒体释放细胞色素C而诱导细胞凋亡［10］。再结合本实验结果，表明在肺I／R中IPO可能抑制p38MAPK激活，减少Bcl-2磷酸化改变，以此来减轻肺组织损伤和肺细胞凋亡。

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