李志海

胃癌细胞多药耐药相关基因的表达与其侵袭转移能力的相关性研究

李志海

目的探讨胃癌细胞株BGC-823、SGC-7901的多药耐药相关基因的表达与其侵袭转移能力的关系。方法采用实时荧光定量PCR技术检测胃癌细胞株BGC-823、SGC-7901的多药耐药相关基因（包括ABCB1、MMP2、CDH1、CD44）的mRNA表达水平。采用细胞划痕实验、Transwell迁徙实验评价两株胃癌细胞的侵袭转移能力，进而探讨胃癌细胞多药耐药相关基因的表达与侵袭转移能力的关系。结果荧光定量PCR实验发现胃癌细胞株BGC-823的ABCB1、CDH1、CD44基因表达较SGC-7901高，而MMP2基因的表达在SGC-7901中较高。细胞划痕实验及Transwell迁徙实验显示胃癌细胞株BGC-823的迁徙能力比SGC-7901强。结论胃癌细胞的多药耐药与侵袭转移有一定的关系，CD44的高表达在胃癌细胞的侵袭转移中可能起主要作用。

多药耐药；侵袭转移；ABCB1；MMP2；CDH1；CD44

胃癌是目前最为常见的恶性肿瘤之一，随着新的化疗药物的不断出现，化疗对胃癌的疗效较以往有了显著提高。然而大部分病人最终因肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性而使化疗失败，并常伴有侵袭转移能力增强而导致病人最后死亡。肿瘤的化疗多药耐药（multidrug resistance,MDR）和侵袭转移（invasion/metastasis）成为了目前肿瘤治疗中的两大难题。为了克服化疗耐药性，减少肿瘤侵袭转移的发生，众多学者在过去的几十年一直致力于对两者关系的研究。本研究选取在癌细胞多药耐药与侵袭转移中起重要作用的E-钙粘蛋白[1]（CDH1基因编码）、金属基质蛋白酶-2（MMP-2基因编码）[2]及与多药耐药密切相关的P-糖蛋白（MDR1基因编码）[3]和CD44[4]等四个基因为对象，进一步在人胃癌细胞株上寻找有关肿瘤多药耐药和侵袭转移相关性的证据。

材料与方法

一、材料

细胞人胃癌细胞株BGC-823、SGC-7901；购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

其他材料细胞培养使用的DMEM培养基干粉购自GIBCO Life Technology公司（Grand Island，NY）；DMEM培养基按GIBCO配方自制；小牛血清购自Hyclone公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；细胞培养板购自BD Falcon公司（BD Biosciences）。用于Western blot分析的抗体Anti-periostin抗体由国外合作实验室提供；Horseradish peroxidase-conjugated IgG抗体购自美国Zymed公司（San Francisco,CA）；其它抗体均购自Santa Cruz公司（Santa Cruz,CA）；聚偏二氟乙烯膜（PVDF）购自Millipore公司；蛋白质分子量标准分别购自Invitrogen或MBI公司。

二、细胞培养

本文选用的细胞都是贴壁细胞，细胞培养在DMEM完全培养基或实验中特殊设计的培养基中，37℃、5%CO2培养箱中通气培养。通常当细胞生长密度到达80%～90%时，需要传代，首先将培养液吸去。加入适量胰酶消化溶液，使其均匀覆盖细胞层，室温放置1～2 min，吸去胰酶消化溶液。待细胞从培养皿上脱落下来后，加入少量培养液终止胰酶的作用，并用移液管数次吹打细胞使其分散。加入适宜体积的培养液，吹打混匀后根据需要接种到不同的培养皿中以备下一步实验之用。

三、实时定量qPCR

从BGC-823、SGC-7901中抽提总RNA，把RNA反转录成cDNA。以β-actin（肌动蛋白）基因（HumanACTB）为内参基因，根据ABCB1、MMP2、CD44、CDH1基因序列信息设计并合成PCR引物，序列见表1。以反转录的cDNA为模板，用目的基因特异性引物和内参引物扩增待检测的目的基因片段和看家基因。

表1 ABCB1、MMP2、CD44、CDH1基因qPCR检测引物信息

四、细胞刮痕实验

将处于对数生长期的目的细胞进行胰酶消化，计数、制成细胞悬液。将细胞悬液（细胞数约为1× 106）接种于6-well中，37℃，5%CO2培养箱培养待细胞融合度达到约95%。在单层细胞培养细胞上，用200 μL枪头沿培养板底部整齐垂直呈“一”字形划痕，划线时一定要呈直线，让细胞断层边缘尽量的平滑，便于观察细胞迁移。无血清培养基洗涤多次，去掉漂浮在上清里的细胞，然后每孔加入2 mL无血清培养基进行培养。在6孔板板盖上用记号笔垂直于划痕画4～5道线，拍照时光斑落在交叉区域，利于不同时间点拍照时在同一个地方进行观察。培养板放回37℃、5%CO2培养箱内进行培养。

五、Transwell实验

在接种细胞前，向小室中加入600 μL PBS，室温下放置30 min充分浸润小室；吸出PBS后，在安全柜中自然晾干，约30 min；用胰酶消化细胞，细胞计数，调整细胞浓度到2×106/mL；加入0.1 mL细胞悬液于小室中，同时加入0.65 mL完全培养基于下层孔板中；用镊子将小室仔细放到加有培养基的孔板中（应避免底部产生气泡），置于培养箱中培养；每天观察迁移情况，一般在48～72 h时，停止培养；取出小室，去除被子中的上清，用湿润的棉签仔细擦掉小室上层的细胞；室温，PBS稍洗涤。吸取0.5 mL Regent A（洗涤液）于24孔板中，放入小室轻轻摇晃孔板，润洗小室，弃洗液。吸取0.5 mL Regent B（染色液）于另一个孔中，放入小室进行染色，室温放置20 min。取0.5 mL Regent A于步骤1的洗涤孔中，将小室放回洗涤孔中洗涤，重复6次，直到regent A无色时，然后显微镜下拍照。

六、数据统计分析

采用SPSS10.0软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析或配对t检验；计数资料比较采用方差分析。P<0.05被认为有统计学意义。

结果

一、qPCR检测两株细胞株中ABCB1、MMP2、CDH1和CD44基因的表达水平

ABCB1在BGC-823和SGC-7901细胞中表达量非常低。MMP2在BGC-823细胞中表达量非常低。CD44在两株胃癌细胞株中表达较高。CDH1在两株胃癌细胞株中表达较高。两株胃癌细胞株中4个多药耐药相关基因表达的柱状图比较如图1A和1B所示。ABCB1在BGC-823和SGC-7901细胞中表达量较低。MMP2基因在BGC-823细胞中表达量较低，在SGC-7901中表达量中等。CDH1、CD44在BGC-823和SGC-7901中均有较高的表达。

图1 ABCB1、MMP2、CDH1和CD44基因在BGC-823和SGC-7901中的表达

二、细胞划痕结果

细胞划痕后0～30 h内每5 h观测一次划痕的距离并拍照记录。相同时间内，BGC-823细胞的移动距离较远，迁移能力强，SGC-7901的迁移能力较弱，其划痕结果统计如表2所示。

表2 细胞划痕结果统计分析（μm）

三、细胞侵袭实验

在24孔板加入0.5 mL的Regent C（裂解液），放入小室轻轻摇晃孔板，37℃孵育5 min，使小室下层粘附的细胞都裂解于Regent C中，呈蓝紫色澄清溶液，去掉小室，吸取孔板中的溶液100 μL到一个清洁的96孔板中。用酶标仪检测570 nm处的吸光值，然后计算细胞迁移。SGC-7901的细胞迁移能力要弱于BGC-823。见表3。

表3 OD值检测迁移值结果统计

讨论

化疗在胃癌的治疗中占有非常重要的低位，尤其是对于不可切除或有转移的病例。但大部分患者会在化疗开始时及表现为耐药或经过初始的治疗反应后变得耐药[5]。多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时，对其他许多结构不同、作用机制不同的抗肿瘤药物亦产生交叉抗药性[6-7]。多药耐药分为两种：一种是首次使用化疗药物就产生耐药，称为原发性耐药（primary resistance）或天然性耐药（initial resistance）[8-9]；另一种则是在化疗过程中产生耐药，称为继发性耐药（secondary resistance）或称获得性耐药（acquired resistance）[7,10]。

多药耐药的机制包括：由P-gp或其他MRP家族成员的膜蛋白把药物泵出细胞外，药物作用靶点的性质改变，谷胱甘肽S转移酶（GST）对化疗药物的解毒作用增强，化疗药物在人体内未能有效激活，细胞对药物的代谢增强使其变成低毒的小分子，细胞修复功能增强，细胞凋亡受影响等[11]。侵袭转移是另一个导致胃癌患者死亡的原因。随着时间的推移，大约50%的患者终会发生远处转移。胃癌细胞侵犯基底膜和浆膜，越过细胞间隙及细胞外基质，是形成转移的关键步骤。目前公认的癌细胞侵袭转移的机制是有Liotta提出的三步理论[12]细胞表面的受体与细胞外基质粘附，分泌水解酶降解细胞外基质，为肿瘤细胞的运动开辟道路，癌细胞移动到被降解的基质区域。就这样不断地粘附-降解-移动，最终导致局部侵犯和远处转移。在这一过程中，细胞粘附分子的相互作用、细胞外基质、蛋白酶、细胞骨架蛋白、细胞信号转到系统均起到非常重要的作用，并构成复杂的网络。

在本实验中，BGC-823中MMP2基因表达较低，而MDR1、CD44、E-cadherin的表达均较SGC-7901高。在癌细胞的迁徙功能检测中，BGC-823的迁徙能力较强。因此，我们推测在本研究中对汉族起作用的基因不是MMP2，因为MMP2的高表达可导致癌细胞迁徙能力增强，BGC-823细胞中MMP2较低表达与其迁徙能力较强不一致。另外，BGC-823细胞株来自于胃癌原发组织，而SGC-7901来自于胃癌的转移淋巴结。根据以往的经验，转移性病灶较原发灶有更强的耐药性和侵袭能力，因此实验前我们推测SGC-7901的迁徙能力可能会较BGC-823强，但实验结果明确显示BGC-823的迁徙能力强。这项结果与之前的推测不一致，可能是由于这两株胃癌细胞不是来自同一患者，即不是同一亲代细胞来源的克隆，基因表达谱不同，而BGC-823来源的标本术后病理为低分化腺癌，恶性程度较高，可解释上述不一致。

本实验中，两株胃癌细胞的MDR1基因表达均较低，考虑原因为两株胃癌细胞均为术后标本直接取材培养，未经化疗药物的诱导，故MDR1低表达。所以，在本实验中期主要作用的基因为CD44、E-cadherin。而CD44、E-cadherin的作用相反，CD44介导癌细胞的转移，E-cadherin则使肿瘤组织趋于稳定，本实验中CD44、E-cadherin在BGC-823中表达较高，故CD44在促进BGC-823的迁徙中起着关键作用。

1Xu CY,Guo JL,Jiang ZN,et al.Prognostic role of estrogen receptor α and estrogen receptor β in gastric cancer.Ann Susg Oncol,2010, 17(9):2503-2509.

2Chen PN,Chu SC,Kuo WH,et al.Epigallocatechin-3 gallate inhibits invasion,epithelial?mesenchymal transition,and tumor growth in oral cancer cells.J Agr Food Chem,2011,59(8):3836-3844.

3Sharma G,Mirza S,Parshad R,et al.CpG hypomethylation of MDR1 gene in tumor and serum of invasive ductal breast carcinoma patients.Clin Biochem,2010,43(4-5):373-379.

4Yuan G,Regel I,Lian F,et al.WNT6 is a novel target gene of caveolin-1 promoting chemoresistance to epirubicin in human gastric cancer cells.Oncogene,2012,32(3):375-387.

5Kim HK,Choi IJ,Kim CG,et al.A gene expression signature of acquired chemoresistance to cisplatin and fluorouracil combination chemotherapy in gastric cancer patients.PLoS One,2011,6(2): e16694.

6Song W,Jiang R,Zhao CM.Role of integrin-linked kinase in multi-drug resistance of human gastric carcinoma SGC7901/DDP cells. Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(11):5619-5625.

7Qi J,McTigue MA,Rogers A,et al.Multiple mutations and bypass mechanisms can contribute to development of acquired resistance to MET inhibitors.Cancer Res,2011,71(3):1081-1091.

8Miranda C,Nucifora M,Molinari F,et al.KRAS and BRAF mutations predict primary resistance to imatinib in gastrointestinal stromal tumors.Clin Cancer Res,2012,18(6):1769-1776.

9Huang S,Chen M,Shen Y,et al.Inhibition of activated Stat3 reverses drug resistance to chemotherapeutic agents in gastric cancer cells.Cancer Lett,2012,315(2):198-205.

10 Roukos DH.Targeting gastric cancer with trastuzumab:new clinical practice and innovative developments to overcome resistance.Ann Surg Oncol,2010,17(1):14-17.

11 Geng M,Wang L,Chen X,et al.The association between chemosensitivity and Pgp,GST-π and Topo II expression in gastric cancer.Diagn Pathol,2013,8:198.

12 Liotta LA,Kleinerman J,Catanzaro P,et al.Degradation of basement membrane by murine tumor cells.J Natl Cancer Inst,1977,58 (5):1427-1431.

（本文编辑：南清振）

医学论文中有关统计学方法使用的要求

应告知研究设计的名称和主要方法。如调查设计分为前瞻性、回顾性还是横断面调查研究，实验设计应告知具体的设计类型，临床试验设计应告知属于第几期临床试验，采用了何种盲法措施等；主要做法应围绕重复、随机、对照、均衡概要说明，尤其要告知如何控制重要非试验因素的干扰和影响。应注明所采用的统计学处理方法，在P值前标注统计量，如t值、F值、χ2值等。统计学符号按GB 3358-82《统计学名词及符号》的有关规定书写，一律用斜体。

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The expression of multidrug resistance related genes and invasion/metastasis ability of gastric cancer cell

LI Zhi-hai.Department of Gastroenterology,Xiangyang People′s Hospital;441001

Objective To investigate the relationship between the expression of multidrug resistance related genes and invasion/metastasis ability of gastric cancer cell.Methods mRNA of multidrug resistance related genes(including ABCB1,MMP2,CDH1,CD44)in gastric cell lines BGC-823 and SGC-7901 were validated by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR)technique.Invasion/metastasis ability was assessed by cell scratch test and transwell migrating test.Then,the relationship between the expression of multidrug resistance related genes and invasion/metastasis ability was explored.Results FQ-PCR test revealed that the expression level of ABCB1,CDH1,and CD44 was higher in cell line BGC-823,while the expression level of MMP2 was higher in cell line SGC-7901.Cell scratch test and transwell migrating test revealed cell line BGC-823 had more powerful migrating ability.Conclusion Multidrug resistance related genes and invasion/metastasis ability of gastric cancer cell were relevant.High expression of CD44 may play an important role in invasion/metastasis.

Multidrug resistance;Invasion/metastasis;ABCB1;MMP2;CDH1;CD44

2014-07-07）

10.3961/j.issn.1672-2159.2014.04.003

441001襄阳市襄州区人民医院消化内科