王晓山 张占学 林 林 李 涛 邱少凡 张海强 宋伟庆

miR-126在人结肠癌细胞中的表达及其对结肠癌细胞耐药性的影响

王晓山1张占学2林 林2李 涛2邱少凡2张海强2宋伟庆2

目的探讨miR-126在人结肠癌细胞中的表达及其对结肠癌细胞的耐药性影响。方法采集我院肿瘤科2010年7月至2013年8月收治的45例结肠癌患者的癌组织、癌旁组织及30例同期体检健康对象的正常结肠组织（正常组织），采用荧光PCR检测miR-126表达水平；体外培养HCT116细胞，通过转染抑制序列抑制miR-126的表达，检测抑制HCT116细胞miR-126的表达对结肠癌细胞耐药性的影响。结果结肠癌组织的miR-126阳性表达率显著低于癌旁组织、正常组织（P<0.05）；癌旁组织的miR-126阳性表达率低于正常组织但差异不显著（P>0.05）；miR-126表达在年龄、性别、分化程度、肿瘤大小间差异不显著（P>0.05），不具统计学意义；miR-126表达与淋巴结转移、Dukes分期、临床分期具有显著的相关性，且miR-126表达水平在各个层之间差异显著（P<0.05）；在0、5、10、20 mg/L的奥沙利铂培养基中，miR-126阳性组的癌细胞活性（吸光度值）均显著低于miR-126阴性组且差异具有统计学意义（P<0.05）。结论结肠癌组织中的miR-126阳性表达率较低，癌细胞组织中的miR-126阳性表达有利于降低癌细胞的耐药性，有利于对结肠癌的治疗效果。

miR-126；结肠癌；细胞的转移；耐药性；增值能力

资料与方法

一、一般资料

本研究选取我院肿瘤科2010年7月至2013年8月收治的45例结肠癌患者及体检中心提供的30例正常研究对象。纳入标准：①结肠癌的诊断均经过术前病理学及术后病理组织活检确诊；②患者术前均未接受过放疗和化疗。排除标准：手术治疗前接受过放疗或化疗的患者，未经过病理组织学检查确诊的患者。

本次研究共纳入75例研究对象，结肠癌患者45例，男性27例、女性18例，年龄47～72岁，平均年龄（58.4±10.5）岁；体检健康对象30例，男性18例、女性12例，年龄44～72岁，平均年龄（55.3± 9.7）岁；结肠癌患者和健康对象的年龄、性别等一般资料比较差异不具有统计学意义（P>0.05）。

二、方法

1.细胞培养

HCT116细胞（高转移结肠癌细胞株）培养于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于95% O2、5%CO2、37℃的恒温培养箱中，细胞铺满瓶底80%～90%时进行常规传代。采用上海吉玛公司化学合成的miR-126的抑制序列和阴性对照序列转染HCT116细胞，具体序列如下：miR-126的抑制序列：5′-CGCAUUAU UACUCACGGUACGA-3′，阴性对照序列：5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′[3]。细胞转染步骤：转染前一天，将长至80%融合的HCT116细胞传代至6孔板，1×108个/孔，转染当日严格按照转染试剂lip2000试剂盒（invitrogen公司）说明书进行，转染后24 h，分别将转染两种序列的细胞（标记为miR-126阴性细胞和miR-126阳性细胞）传代至96孔板中，10 000个细胞/孔，分别用含有0、5、10、20 mg/L的奥沙利铂培养基对两种癌细胞进行培养，其中每个浓度设5个平行孔，培养72 h使用MTT实验检测细胞的吸光度。

2.RT-PCR

取待测结肠癌患者的病变组织、癌旁组织和正常组织100 g加入1 mL Trizol试剂（invitrogen公司），匀浆器匀浆，按照按RNeasy mini kit RNA试剂盒（TAKARA公司）说明书纯化总RNA，反转录为cDNA，合成引物：上游：5′-GGGGTCGTACCGTGAGT-3′，下游：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，循环参数为：95℃变性5 min，95℃，10 s；60℃，20 s；72℃，20 s；78℃，20 s（收集荧光），共40个循环。

3.分组方法

将我院肿瘤科2010年7月至2013年8月收治的45例结肠癌患者的癌组织、癌旁组织及30例同期体检健康对象的正常结肠组织（正常组织）；同时根据实验结果将癌组织根据miR-126表达情况分为miR-126阳性组和miR-126阴性组，两组标本患者的年龄、性别等一般资料比较差异不显著（P> 0.05）。

三、统计方法

所有收集数据录入Excel2003，在spss10.0中进行统计分析。计量资料以（x±s）表示，采用两独立样本t检验、计数资料以%表示，采用卡方检验、非参数检验，检验水准取α=0.05。

结果

一、不同结肠组织的miR-126阳性表达情况

结肠癌组织的miR-126阳性表达率显著低于癌旁组织、正常组织（P<0.05）；癌旁组织的miR-126阳性表达率低于正常组织但差异不显著（P> 0.05）；详见表1。

二、miR-126表达与结肠癌不同临床特征的相关性

45例患者的结肠癌组织中：miR-126表达在年龄、性别、分化程度、肿瘤大小间差异不显著（P> 0.05），不具有统计学意义；miR-126表达与淋巴结转移、Dukes分期、临床分期具有显著的相关性，且miR-126表达水平在各个层之间差异显著（P< 0.05），详见表2。

三、miR-126抑制序列对HCT116细胞中miR-126表达的抑制效果

分别用miR-126抑制序列及对照序列转染HCT116细胞，通过RT-PCR检测两株细胞中miR-126的相对表达量，结果显示miR-126抑制序列成功的抑制了HCT116细胞中miR-126的表达水平，明显低于正常HCT116细胞（P<0.01），而miR-126对照细胞中miR-126的表达水平与正常HCT116细胞没有明显差异，结果见表3。

表1 不同结肠组织的miR-126阳性表达情况[n（%）]

表2 miR-126表达与结肠癌不同临床特征的相关性（n）

表3 两种转染细胞中的miR-126的表达量（x±s）

四、不同浓度的奥沙利铂培养基对结肠癌细胞活性的影响

对miR-126抑制和miR-126阴性对照组细胞采用奥沙利铂培养基培养，结果在0、5、10、20 mg/L的奥沙利铂培养基中，miR-126抑制组的癌细胞活性（吸光度值）均显著高于miR-126对照组且差异具有统计学意义（P<0.05），详见表4。

表4 不同浓度的奥沙利铂培养基下结肠癌细胞的吸光度值（x±s）

讨论

结肠癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，起源于结肠黏膜上皮，目前尚无有效的治疗方法，临床上主要以手术切除、放化疗及生物治疗，因其易出现转移和化疗药物耐药，致使死亡率逐年升高，了解结肠癌转移及耐药的机制对于患者的治疗具有重要的作用。但因其机制复杂，涉及到很多癌基因及抑癌基因的表达异常，miRNA表达异常也是其中的重要环节。MicroRNA（miRNA）是近年来发现的一类长度约为19～25 nt的内源性小分子非编码RNA，它通过与靶mRNA的3′端非翻译区完全或不完全互补调控转录后基因的表达，从而影响细胞的分化、增殖、凋亡和机体发育等过程，类似具有癌基因和抑癌基因的功能。

miRNA-126是近年来研究比较热的小RNA分子，其定位于9q34.3（EGFL7基因第7个内含子中），发挥抑制肿瘤转移的作用，属于抑癌基因的范畴，其表达异常与肿瘤的发生发展有关[4]。很多研究显示在乳腺癌、淋巴癌、宫颈癌[5]、胃癌等肿瘤组织中miRNA-126的表达水平明显降低，如果恢复癌组织中miRNA-126的表达水平，或者在癌细胞中过表达miRNA-126，可以抑制肿瘤的生长、迁移和体内的成瘤能力[6]。但是miRNA-126并不是在所有的肿瘤中都呈现低表达状态，有研究显示miRNA-126在急性巨核细胞白血病细胞[7]、急性髓性白血病细胞、食管腺癌等癌组织呈现高表达。在本研究中拟对65例结肠癌患者的miRNA-126表达进行检测，确定其在肿瘤发生中的作用，结果显示结肠癌组织的miR-126阳性表达率显著低于癌旁组织、正常组织，说明miR-126的表达降低参与了结肠癌的发生，同时为了进一步证实miR-126在结肠癌发生发张中的作用，本研究对65例患者的年龄、性别、是否出现淋巴结转移、临床分期、肿瘤大小等情况与miR-126表达情况进行了相关性分析，结果显示miR-126表达与淋巴结转移、Dukes分期、临床分期具有显著的相关性，miR-126阴性的患者出现肿瘤转移的几率较大，而且临床分期Ⅲ+Ⅳ期的患者比例比较大，提示miR-126低表达参与了肿瘤转移的发生，加速病情恶化，与结肠癌患者的病情的发展密切相关，与文献报道一致[8]。

为了进一步研究miR-126对结肠癌耐化疗药物的影响，本研究中人工合成了沉默miR-126的短序列和对照序列，以HCT116细胞作为研究对象，通过转染的方法构建了低表达miR-126的HCT116的细胞和正常表达miR-126对照细胞，给予不同浓度的奥沙利铂药物，然后检测两种不同细胞的增殖状态，结果显示miR-126抑制组的癌细胞活性（吸光度值）均显著高于miR-126对照组，说明抑制miR-126的表达降低了细胞对化疗药物的敏感性，是造成肿瘤耐药的可能因素[9]。因此在结肠癌患者的化疗过程中，采用可以恢复miR-126表达的药物可以提高治疗效果[10]。

在结肠癌的发生发展中miR-126低表达可能通过三种机制参与，一是作用于肿瘤本身，促进肿瘤生长；二是促进肿瘤转移；三是降低肿瘤细胞对于化疗药物的敏感性，从而降低治疗的效果。因此在结肠癌的治疗过程中，要加强对患者miR-126的筛查，防止癌细胞转移，对于确诊为结肠癌的患者，检测miR-126的表达水平，指导临床用药和预后判断，具有重要意义。

1李楠,李夏雨,黄铄,等.miR-126靶向调控IRS1，SLC7A5及TOM1基因抑制结肠癌的增殖及侵袭转移.中南大学学报（医学版),2013,38(8):809-816.

2郑志伟,劳海燕,余细勇,等.冠心病患者血浆循环miR-126的表达及其对血管内皮细胞的影响.中国病理生理杂志,2011,27(12): 2313-2317.

3蔡惠,王健生,张明鑫,等.hsa-miR-126和hsa-miR-518b在食管鳞癌中的表达.南方医科大学学报,2011,31(1):23-27.

4Feng R,Chen X,Yu Y,et al.miR-126 functions as a tumour suppressorin human gastric cancer.Cancer Lett,2010,298(1):50-63.

5刘琳,王月玲,王江芬.miR-21、miR-126、miR-143和miR-373在正常宫颈组织、宫颈癌组织及Hela细胞中的表达差异.四川大学学报（医学版）,2012,43(4):536-539.

6Png KJ,Halberg N,Yoshida M,et al.A microRNA regulon thatmediates endothelial recruitment and metastasis by cancer cells.Nature,2011,481(7380):190-194.

7Li ZJ,Lu J,Sun M,et a1.Distinct microRNA expression profiles in acute myeloid leukemia with common translocations.Proc Natl A－cad Sci USA,2008,105(40):l5535-l5540.

8林孟波,王金泗,薛芳沁,等.miR-126在人结肠癌细胞中的表达及其对结肠癌细胞生物学行为的影响.疑难病杂志,2014,13(4): 395-398.

9Liu B,Peng XC,Zheng XL,et a1.MiR-126 restoration downregulate VEGF and inhibit the growth of lung cancer cell lines invitro and in vivo.Lung Cancer,2009,66(2):169-175.

10 Miko E,Margtai Z,Czimmerer Z,et al.miR-126 inhibits proliferationof small cell lung cancer cells by targeting SLC7A5.FEBS Lett, 2011,585(8):1191-1196.

Expression of miR-126 in human colon cancer cells and its effect on drug resistance

WANG Xiao-shan1, ZHANG Zhan-xue2,LIN Lin2,LI Tao2,QIU Shao-fan2,ZHANG Hai-qiang2,SONG Wei-qing2.1)Department of General Surgery,People′s Hospital of Weixian County,Xingtai,Hebei Province,054700;2)Department of Gastrointestinal Surgery,Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang,Hebei Province,050000

Objective To investigate the expression of miR-126 in human colon cancer cells and its effect on drug resistance.Methods Forty five cases of colon cancer tissues,para-carcinoma tissues and 30 cases of normal colon tissues were collected from July 2010 to August 2013 in Department of Oncology of our hospital.By detecting miR-126 expression levels using fluorescent PCR,culturing HCT116 cells in vitro,suppressing the expression of miR-126 by transfecting the suppressing sequence,we studied the drug resistance effect of miR-126 in HCT116 cells.Results The positive rate of miR-126 expression in colon cancer tissues was significantly lower than that in para-carcinoma tissues and normal tissues(P<0.05);moreover,this rate in para-carcinoma tissues was also lower than that in normal tissues,but the difference was not significant(P> 0.05).No significant differences of miR-126 expression in age,gender,differentiation，and,tumor size were observed(P>0.05),but miR-126 expression was found to be associated with lymph node metastasis,Dukes′staging and clinical staging;the differences among miR-126 expression levels was also significant(P<0.05). In 0,5,10,20 mg/L oxaliplatin medium,cancer cell activity(absorbance)in miR-126 positive group was significantly lower than in miR-126 negative group(P<0.05).Conclusion The positive expression of miR-126 in colon cancer tissues is relatively low,whereas this positive expression can reduce drug resistance of cancer cells and is beneficial to the treatment of colon cancer.

MiR-126;Colon cancer;Metastasis;Drug resistance;Proliferation ability结肠癌是临床上常见的消化道恶性肿瘤，死亡率很高，大约能达到新发病人数的50%，严重威胁患者的健康和生命。目前对于结肠癌的治疗效果还不是很理想，早期手术预后较好，但是晚期患者的5年生存率仅达到20%左右，死亡的原因大多是肿瘤转移，因此了解结肠癌转移的相关因素对于治疗具有一定的指导作用[1]。miRNA是长约20～22个核苷酸的微小非编码RNA，在细胞的分化、凋亡、增殖、迁移等生物学过程中发挥了重要作用，而且有研究显示其具有类似癌基因与抑癌基因的功能，在肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色[2]。在本研究中，通过检测miR-126在人结肠癌细胞中的表达并分析对结肠癌细胞耐药性的影响，从而阐明miR-126在结肠癌的发生发展的作用，为结肠癌的临床治疗提供依据。

2014-07-09）

（本文编辑：龚伟）

10.3961/j.issn.1672-2159.2014.04.005

1 054700邢台市威县人民医院普外科；

2 050000河北医科大学第二医院胃肠外科

张占学，E-mail：13363858865@189.cn