吴 侗，周 彬，龙 丽，张 晶，孙晓麟，李英妮

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院风湿免疫科，四川 成都610072;2.北京大学人民医院风湿病研究所，北京100044)

干燥综合征(primary Sj gren＇s syndrome，PSS)是一种以外分泌腺淋巴细胞高度浸润的自身免疫性疾病，人们常常注意的是PSS 的口眼干燥、肾脏受损等症状。随着对该病的认识加深，发现该病对非外分泌腺组织也可侵犯，其中血液系统损害较为常见，发病率34% ～44%，目前主要针对器官损害的研究不多，对血液系统损害的研究更少。血小板减少是PSS 血液系统损害常见表现，可以单独出现也可以合并贫血和白细胞减少出现，北京大学人民医院任立敏医生调查发生率在13% ～20%［1］，并且PSS 产生大量异常的自身抗体是其主要发病机制，自身免疫因素也是导致PSS 血小板减少的主要原因。血小板生成素(thrombopoietin，TPO)及其受体(c-mpl)是促进巨核细胞成熟分化释放血小板的主要细胞因子［2～9］。本研究旨在探讨抗c-mpl 抗体与PSS 患者血小板减少之间的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取北京大学人民医院风湿免疫科2012 年1 月至2013 年1 月住院的PSS 患者共计80 例，均符合2002 年干燥综合征国际分类(诊断)标准。其中血小板减少患者40 例(血小板＜100×109/L，A 组)，无血小板减少40 例(B 组)。选择同期住院的抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome，APS)患者40 例(C 组)，均符合2004 年修订的APS分类诊断标准;无血小板减少的系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)患者24 例(D组)，均符合1997 年美国风湿病学会指定的SLE 诊断标准;正常体检的健康志愿者40 例(E 组)，血小板计数正常并且无风湿免疫病和血液病病史。A 组男4 例，女36 例，年龄(55.64±14.98)岁(22 ～78岁);B 组男3 例，女37 例，年龄(55.56±11.13)岁(23～77 岁);C 组男3 例，女37 例，年龄(58.28±16.11)(19 ～74 岁);D 组男2 例，女22 例，年龄(49.12±14.24)岁(18 ～76 岁);E 组男4 例，女36 例，年龄(50.47±12.76)岁(19 ～69 岁)。5 组年龄、性别构成差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 检测方法 ①血清抗c-mpl 抗体和血清TPO水平的检测:采集所有受试者清晨空腹静脉血3 ml，分离血清，-80 ℃保存。酶联免疫吸附法(enzymelinked immuno sorbent assay，ELISA)检测血清TPO水平(试剂盒美国R＆D system 公司)，具体步骤按照试剂盒说明书进行。间接ELISA 法测定抗c-mpl抗体水平，具体步骤为:用重组人c-mpl(美国R＆D system 公司)，以1 mg/L 浓度包被96 孔板(美国costar 公司)，4 ℃过夜，PBST(2%tween 欧蒙公司)洗涤后用0.05 g/L 小牛血清蛋白(bovine serum album，BSA，SIGMA 公司)封闭非特异位点，37 ℃孵育1 h，洗涤后每孔加样本血清(1 ︰200)100 μl，37 ℃孵育30 分钟，洗涤后加辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗人IgG(北京中杉金桥公司)100 μl/孔，37 ℃孵育30 分钟，洗涤后加TMB(欣博盛公司)显色剂100 ℃/孔，室温避光反应10分钟，2 mol/L 稀硫酸100μl/孔终止反应。BIORAD 公司iMARK 酶标仪最后测定450/570 nmOD光密度值，以OD 值大于健康对照组平均值2.1 倍为阳性。②所有PSS 患者均测定血常规、肝肾功、血沉(ESR)、免疫球蛋白(IgG/A/M)、补体C3/C4、ANA、ENA 谱、抗磷脂抗体ACL、β2-GP1 抗体、α-胞衬蛋白抗体，并且进行骨髓涂片，了解骨髓增生分级(I ～V 级)及有无巨核细胞成熟障碍。

1.3 统计学方法 运用SPSS 17.0 软件进行统计分析。计量资料正态分布者用均数±标准差表示，采用t检验或方差分析;非正态分布者采用非参数检验(Mann-Whitney U 检验、Kruskal-Wallis 检验或Wilcoxon 检验)。计数资料采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。相关性分析使用person 检验。

2 结果

2.1 血清抗c-mpl 抗体 血清抗c-mpl 抗体在A、B、C、D 和E 组中的检出率为62.5% (25/40)、27.5%(11/40)、12.5% (5/40)、12.5% (3/24)和0。组间比较差异有统计学意义(χ2=30.571，P＜0.001)。单独比较A 组与B 组血清抗c-mpl 抗体差异也有统计学意义(χ2=10.666，P=0.001)。5 组抗c-mpl 抗体的OD450 值比较见表1。其中A 组与B、C、D、E 组间差异均有统计学意义(见表1、图1)。其余各组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表1 5 组抗c-mpl 抗体的OD450 值比较

2.2 血清TPO 水平 血清TPOA 组(199.74±29.99)pg/ml，B 组(124.19±12.25)pg/ml，E 组(14.04±1.71)pg/ml，A、B 组与E 组间差异均有统计学意义(t值分别为6.66 和10.136，均P＜0.001)，A、B 两组间差异也有统计学意义(Z= -2.884，P=0.004)，见图2。抗c-mpl 抗体阳性与阴性患者血清TPO 水平差异无统计学意义［(180.14±23.07)pg/ml VS.(147.32±23.71)pg/ml，P＞0.05。但分析其中3 例TPO 水平明显升高超过400 pg/ml患者临床资料，发现骨髓巨核细胞明显减少，而循环血小板计数并非显著下降。

2.3 血清抗c-mpl 抗体与血小板计数及其他临床情况的关系 分析80 例PSS 患者抗c-mpl 抗体OD450 指数与血小板计数，发现两者间存在线性负相关性(r=-0.32，P= 0.004)，见图3。PSS 患者抗c-mpl 抗体OD450 指数与抗SSA 抗体具有相关性(P＜0.05)，与ESR、IgG、IgA 数值水平呈线性正相关(r分别为0.299、0.507、0.413，P＜0.05)，见图4～6。抗c-mpl 抗体与病程、性别、IgM、C3/C4、RF、CRP、α-胞衬蛋白抗体、ACL、β2-GP1 抗体、ANA 类型和SSB 等ENA 谱无相关性。

图1 PSS 血小板减少组与PSS 血小板正常组、APS、SLE 血小板正常组、正常对照组间抗c-mpl 抗体OD450 的比较

图2 PSS 血小板减少组与PSS 血小板正常组、正常对照组之间TPO 水平的比较

图3 抗c-mpl 抗体OD450 与血小板计数呈线性负相关

2.4 血清抗c-mpl 抗体与骨髓增生分化的相关性相关性分析显示，PSS 患者抗c-mpl 抗体与骨髓增生低下(IV ～V 级)无相关性(χ2= 0.152，P=0.762)，而与巨核细胞成熟障碍(χ2=7.214，P=0.011)，及骨髓血小板生成减少具有相关性(χ2=8.209，P= 0.006)。

3 讨论

TPO 主要作用是促进巨核细胞增殖和成熟分化，促进血小板生成。TPO 及其受体c-mpl 信号通路位于造血干/祖细胞(HSC/PC)和巨核细胞膜表面，TPO 通过与c-mpl 受体结合，产生信号传递，促进细胞分裂增殖和分化成熟［2～9］。血清中TPO 浓度主要受循环中血小板计数和骨髓中巨核细胞分化程度调控，对血小板减少性疾病有鉴别意义。抗cmpl 抗体在2002 年由Kuwama 等［10］首次提出，研究者发现部分SLE 血小板减少患者骨髓巨核细胞数目减少［11～13］，猜测可能存在抗c-mpl 抗体，此后应用ELISA 法检测发现了抗c-mpl 抗体。抗c-mpl 抗体可与TPO 竞争结合细胞膜上的c-mpl，阻断TPO/c-mpl 信号通路。既往认为SLE 相关血小板减少与循环中血小板破坏过多有关，但SLE 巨核细胞增殖分化障碍导致血小板减少时有报道［14～15］。目前研究［10］已证实抗c-mpl 抗体存在于SLE 血小板减少和骨髓巨核细胞成熟障碍患者循环血清中，研究发现，从SLE 抗c-mpl 阳性患者血清中纯化的IgG 片段可以结合在细胞表面c-mpl 上，阻断TPO 介导的巨核细胞单克隆形成，因此SLE 患者的巨核细胞成熟障碍血小板减少被认为是由于抗c-mpl 功能性阻断了TPO 与c-mpl 结合活动所致。抗c-mpl 抗体并不是SLE 特异性抗体，研究发现在系统性硬化(SSc)合并血小板减少和特发性血小板减少(ITP)中也检测出该抗体。Katsumata 等［16］报道了1 例系统性硬化血小板减少患者，其检测抗磷脂抗体、抗血小板抗体、抗TPO 抗体均为阴性，而抗c-mpl 抗体阳性，骨髓巨核细胞成熟障碍，进一步提示抗c-mpl 抗体与骨髓巨核细胞数减少血小板减少之间的关系。

本研究选择了PSS 血小板正常患者与SLE 血小板正常患者进行检测，发现两组抗c-mpl 抗体与正常对照者无统计学意义，提示抗c-mpl 抗体不是PSS、SLE 等自身免疫疾病特异抗体。PSS 伴有血小板减少患者检测发现抗c-mpl 抗体明显高于正常对照和其他自身免疫疾病患者，OD450 检测值与血小板计数呈负性线性相关，提示抗c-mpl 抗体水平与干燥综合征血小板减少呈正相关。本研究发现抗磷脂综合征患者抗c-mpl 抗体水平与正常对照无统计学差异，而PSS 血小板减少患者抗c-mpl 抗体与抗磷脂抗体(ACL)无相关性，提示抗磷脂综合征相关血小板减少与抗c-mpl 抗体相关性较小，而PSS 的血小板减少与血栓形成无相关性。本研究发现抗cmpl 抗体0D450 检测值与ESR、血清高球蛋白(IgG/IgA)呈线性正相关，提示抗c-mpl 抗体与病情活动相关。病情活动越明显该抗体滴度越高，提示该抗体可用于PSS 血小板减少患者病情预测和治疗效果评价。本研究发现抗c-mpl 抗体与PSS 患者骨髓巨核细胞成熟障碍具有一定相关性，因此PSS 血小板减少的致病机制很可能像SLE 一样，是由于抗cmpl 抗体导致的巨核细胞成熟障碍所致。激素治疗原发性干燥综合征血小板减少常常疗效不如ITP 患者明显，多数患者需要数月甚至更长时间才能血小板计数回升，具体的机制目前尚不明确，但可能与造血干细胞需要较长时间分化、巨核细胞成熟和增殖功能恢复有关。目前研究［17］显示经过激素和免疫抑制剂治疗后SLE 患者血小板计数恢复，并且抗cmpl 抗体转阴，提示不仅血小板减少与抗c-mpl 抗体导致的巨核细胞成熟障碍相关，而且抗c-mpl 抗体可用于判断治疗疗效。本研究中PSS 血小板减少组和血小板计数正常组TPO 水平明显高于正常对照组，并且血小板减少组TPO 水平高于血小板正常PSS 患者组，提示TPO 水平与血小板数目呈一定相关性，血小板计数越低TPO 水平越高。抗c-mpl 阳性组与抗体阴性组相比TPO 水平无差异，提示抗cmpl 抗体不影响TPO 代谢，而是通过竞争TPO 受体c-mpl 与之结合阻断TPO 促进巨核细胞分化成熟发挥作用。3 例TPO 水平超过正常对照30 倍患者的骨髓巨核细胞成熟障碍较循环血小板计数下降更明显，提示巨核细胞发育程度对TPO 调节作用更明显。本研究中血小板减少与抗c-mpl 抗体阳性并不是一一对应，说明PSS 血小板减少可能与一个包括自身免疫反应、血小板分布异常、感染和药物等多种原因的复杂网络相关，抗c-mpl 抗体在网络中具有一定特殊意义，通过巨核细胞成熟障碍参与血小板生成过程，但血小板减少还与其他复杂因素有关。

本研究对PSS 相关血小板减少患者抗c-mpl 抗体作用做出初步的探讨，但其在体内的作用通路机制还需要进一步研究;抗c-mpl 抗体能否用于临床病情预测、治疗评估还需要大样本数据的分析;促TPO 受体激动剂及针对抗c-mpl 抗体的单克隆生物制剂是否是血小板减少患者治疗的新靶点新方向还需要进一步研究证实。

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