朱九群，傅 川，何 林，曾明辉

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院药学部，四川 成都610072;2.重庆医科大学附属永川医院药学部，重庆 永川402160;3.四川省邛崃市医疗中心医院药学部，四川 邛崃611350)

青蒿素(ART)是从菊科植物黄花蒿(artemisia annua L.)中提取得到的一种内含过氧化基团的倍半萜内酯化合物。近年来的相关研究已证实，青蒿素具抗肿瘤活性［1，2］，且治疗浓度的青蒿素及其衍生物对正常细胞几乎无作用。青蒿素为脂溶性药物，传统增溶方法并不能制成水溶液，不利于肺部给药，且消除速率快，而固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)具有生物相容性好、毒性低、增溶、缓释、被动靶向等特点，是一种较理想的载药系统。我们在前期的研究中已建立了HPLC-MS 法测定大鼠血浆中青蒿素的浓度并将其用于肺部给药后青蒿素浓度的测定［3］，本研究在成功制得青蒿素固体脂质纳米粒的基础上，考察青蒿素的缓释作用，为青蒿素的进一步开发研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 主要试药:ART-SLN(实验室自制);甲醇为色谱纯;实验用水为超纯水，其余试剂均为分析纯。主要仪器:Waters 600 Controller，Waters 717 plus Autosampler(美国)，SPD-10A UV 检测器(岛津，日本)，恒温摇床(ZHWY-103B，上海智诚分析仪器制造有限公司)，透析袋(MW 1000)。

1.2 方法

1.2.1 高效液相色谱条件 色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18 柱(0.5 μm，4.6×150 mm);流动相:0.05 M;磷酸盐缓冲液(pH 5.8):甲醇(36 ∶64);检测波长:260 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μl;流速:1 ml/min

1.2.2 ART 预处理方法 吸取样品液100 μl 于10 ml 容量瓶内，加入900 μl 的乙醇混匀，再加入4 ml 0.2%的NaOH 溶液，摇匀，置50 ℃水浴反应30 min，冰水浴迅速冷却至室温，再加0.8 M 醋酸溶液定容，摇匀，放置30 min，取续滤液测定。

1.2.3 方法特异性 分别取ART 对照品溶液、空白释药介质和ART 对照品与空白释药介质的混合溶液按1.2.2 项下方法预处理，按1.2.1 项下色谱条件进样分析。

1.2.4 标准曲线的建立 精密吸取储备液(包封率测定法中的储备液，浓度为1.532 mg/ml)适量，采用乙醇逐级稀释制成浓度为100、80、40、20、10、5、2.5 μg/ml 的青蒿素标准溶液。按1.2.2 项下进行HPLC 测定，记录青蒿素峰面积，以峰面积Y 对浓度X 做线性回归。

1.2.5 回收率与精密度 分别精密吸取适量的ART 标准溶液于10 ml 容量瓶内，空白释药介质定容，混匀，制成浓度分别为5、20、80 μg/ml 的青蒿素乙醇溶液，按1.2.2 项下方法处理、测定，平行操作5 份，以实测值与加入值的比值计算回收率。于一天内连续测定5 次，计算日内精密度，连续测定3天，计算日间精密度。

1.2.6 ART-SLN 冻干剂体外释药试验 分别取等体积、约等量的青蒿素乙醇溶液(ART-Sol)和ARTSLN 冻干复溶液于预处理的透析袋中，扎紧两端，混悬于25 ml 释放介质(含4%吐温80 的NS 溶液)中，在(37±0.5)℃恒温振荡器上震荡，转速为100 r/min，定时吸取透析液0.2 ml，并补充等量新鲜释放介质，进行3 次平行试验。采用1.2.2 项下样品处理法处理样品，1.2.1 项下条件进行测定，计算不同时间点药物的累计百分释放量，绘制累积释放曲线。

2 结果

2.1 方法特异性 由试验所得到ART 的保留时间为3.07 min，且空白溶液不干扰测定，见色谱图(图1)。

图1 ART 色谱图

2.2 标准曲线 试验所得回归方程为Y=179X+19.3(r=0.9999)，表明在2.5 ～100 μg/ml 浓度范围内，ART 色谱峰面积与其浓度有良好线性关系。

2.3 精密度与回收率 青蒿素高、中、低浓度回收率分别为102.65%、96.67%、103.92%。日内精密度分别为0.53%、1.19%和3.48%，日间精密度分别为1.39%、2.30% 和5.82%，见表1。表明该HPLC 法适用于本实验释药介质中青蒿素含量的测定。

表1 精密度试验验结果 (n=5)

2.4 ART-SLN 冻干剂体外释药试验结果 ARTSLN 冻干剂体外释药累积释放曲线结果见图2。分别以零级动力学方程、一级动力学方程、Higuchi 方程、R-P 方程和Weibull 方程对青蒿素溶液和纳米粒体外释药数据进行处理，得到回归方程，见表2。由表2 可见，ART 溶液和ART-SLN 胶体溶液的体外释放模型，皆采用Weibull 方程拟合效果最佳。采用Weibull 方程计算ART 溶液的T50 和Td 分别为0.54 h 和1.05 h，ART-SLN 冻干剂的T50 和Td 分别为2.58 h 和3.68 h，分别是溶液组的4.81 和3.47 倍，可见，与ART 溶液相比，ART-SLN 具一定缓释作用。

图2 ART 溶液及ART-SLN 冻干剂释放曲线

3 讨论

3.1 体外释药方法的选择 体外释药性质是评价纳米粒载药系统的一项重要指标。用于纳米粒体外释放研究的方法有动态透析法、水平扩散池法、反相渗析技术、超速离心法、离心超滤法等。本实验采用应用最为广泛的动态透析法考察ART-SLN 的释药性质。由于青蒿素几乎不溶于水，因此选用乙醇溶液而不是水溶液进行溶解;同时，为满足漏槽条件，及考虑青蒿素的含量测定方法，最终选择含4%的吐温80 的生理盐水作为释放介质。

3.2 青蒿素固体脂质纳米粒体外释药行为 从ART-SLN 冻干剂的体外释药曲线可见，ART-SLN 释放较快，2 h 内释放量约为42%，这可能是由吸附或间插在纳米粒表面的ART 解吸附引起的。ARTSLN 的突释效应在体内试验中，可发挥起效快的作用。采用不同的数学模型对体外释放数据进行拟合，ART-SLN 和ART-Sol 的体外释药曲线采用Weibull 方程拟合较好。经计算，ART-SLN 冻干剂的T50 和Td 分别是ART-Sol 组的4.81 和3.47 倍，两者具有统计学差异(P＜0.05)。可见，与ART 溶液相比，ART-SLN 具一定缓释作用，达到预期目标。ART-SLN 的缓释作用在体内试验中能否延长ART的半衰期还有待进一步验证。

表2 体外释放拟合方程

［1］Klonis N，Crespo-Ortiz MP，Bottova I，et al. Artemisinin activity against Plasmodium falciparum requires hemoglobin uptake and digestion［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108(28):11405-11410.

［2］Meunier B，Robert A.Heme as trigger and target for trioxane-containing antimalarial drugs［J］. Accounts of Chemical Research，2010，43(11):1444-1451.

［3］傅川，余继英，邹静，等.HPLC-WS 法测定大鼠血浆中青蒿素浓度及其应用［J］.中国中药杂志，2012，37(19):2964-29671.