赵剑萍，黄晓赤，吴蓉宜，高冬明

(成都市第六人民医院病理科，四川 成都610051)

骨髓活检技术是淋巴造血组织和血液疾病诊断的常用技术，不仅能真实的展示各类细胞的分布情况和增生程度，还能观察骨小梁、脂肪和结缔组织之间的解剖关系［1］，被广泛地应用于临床。在具有完整的临床资料、良好的组织学切片和辅以免疫组化标记的条件下，即使缺少分子遗传学分析，大多数肿瘤可以确诊。骨髓活检组织受取材限制，组织较小，在做免疫组化染色时，如果采用将一张组织切片裱在一张防脱玻片上进行一种抗体的染色方法，一种疾病的诊断通常需要6 张或10 余张切片才能完成诊断所需免疫表型的染色。我科通过长期实践，将骨髓活检组织石蜡连片6 ～8 张共同裱在一张防脱玻片上同时进行6 ～8 种不同抗体的染色，既减少了防脱玻片的使用，缩短了制片时间，又方便医生在诊断中可以对多种抗体的表达进行对比，利于诊断，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院2006 年11 月至2013 年6 月送检的所有骨髓活检标本，共580 例。组织经固定、脱钙后常规脱水、浸蜡、包埋。免疫组化试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化切片的制备 ①将包埋好的骨髓活检组织3 μm 连续切片若干张(根据医生选择的抗体种类决定切片张数)。②取其中3 张蜡片各自贴附于一张防脱玻片上，分别用做HE 染色、网状纤维染色(Gorden-sweet 法)、MPO 免疫组化染色(便于粒细胞计数)。③另取6 张或8 张蜡片分别在同一张防脱玻片一端的宽边贴附2 张蜡片、长边贴附3 张或4 张蜡片，蜡片组织之间的距离为0.5 ～1 cm，用做其他不同抗体的染色。④在贴附有石蜡连片的玻片磨砂端依次标明所要滴加抗体的名称，一个组织对应一种抗体。⑤将准备好的切片置于60℃烤箱中烤片1 ～2 h。

1.2.2 免疫组化染色步骤 免疫组化染色采用二步法PV-9000 试剂盒。①切片脱蜡至水，蒸馏水洗。②高温高压隔水抗原热修复，喷气后计时5 min，停止加热，待高压锅压力恢复常压后，打开锅盖取出烧杯，待修复液自然冷却后将切片放入蒸馏水中洗。③取出切片，甩去切片上多余水分，滴加3%过氧化氢去离子水湿盒室温孵育10 min。④蒸馏水洗，PBS(pH 7.4)冲洗，2 min×3 次。⑤甩去切片上多余水分后再用韧性好、吸水性强的纸擦干组织之间的水分(对组织进行封边，避免抗体外溢，保证抗体浓度不被稀释)，按照玻片磨砂端标明的不同抗体的名称依次滴加相应的一抗，37 ℃湿盒孵育2 h或4 ℃过夜。⑥PBS(pH 7.4)冲洗，2 min×3 次。滴加试剂1(Polymer Helper)，37 ℃孵育30 min。⑦PBS(pH 7.4)冲洗，2 min×3 次。滴加试剂2(pohyper oxidase-anti-mouse/rabbit IgG)37 ℃孵育30 min。⑧PBS(pH 7.4)冲洗，2 min×3 次，DAB 显色，镜下控制显色反应，蒸馏水冲洗，终止反应。⑨自来水充分冲洗，苏木精复染，分化，返蓝，脱水，透明，封片。

1.2.3 质量控制 在用吸水性强的纸进行组织封边时要确保擦干组织之间的水分，这一步骤是保证抗体不外溢、一抗之间不发生交叉的关键;在每一批的免疫组化操作过程中设置阳性对照、阴性对照。

2 结果

MPO 在骨髓活检病理诊断中是涉及粒细胞计数的一个重要指标，因此单独用一张切片染色更能保证诊断的准确性(图1);骨髓活检组织石蜡连片在免疫组化染色后各组织之间界限清楚，多种抗体染色互不干扰，切片背景干净、无非特异性着色，阳性定位准确(图2、图3)，便于阅片。

图1 免疫组化染色MPO(PV-9000 法×10)

图2 裱有多种标记的骨髓活检石蜡连片的免疫组化切片

图3 免疫组化染色FⅧ(PV-9000 法×10)

3 讨论

采用骨髓活检石蜡连片进行免疫组化染色，对疑为淋巴造血组织肿瘤的病例可以实现在一张玻片上完成所有T 细胞标记、B 细胞标记或T/B 细胞的标记等，使用3 张防脱玻片就可完成13 ～17 种抗体的标记，完全能满足诊断需要;对于非肿瘤性疾病，只需2 张防脱玻片即可完成诊断所需的免疫组化染色(MPO，染色1 张，其余抗体的染色用贴附有石蜡连片的玻片1 张)。这种染色方法的优点是:①减少了防脱玻片的使用;②用纸吸水法替代其他封边法进行组织封边，简单、方便、成本低廉，手工免疫组化染色尤为适用;③所用抗体均为病理科常用抗体，无需专门购买双染试剂盒;④多张组织在同一张玻片上，实验条件一致，减少了不同染色玻片人为造成的差异;⑤医生可以在一张玻片上完成多种抗体染色结果的判读。缺点是不能直观地显示两种抗原在同一细胞或组织内的相互关系;不适用于免疫组化全自动染色仪。

要做好骨髓活检组织石蜡连片的免疫组化染色，有几点值得注意:①固定:良好的固定是制出优质切片的先决条件，用10%中性福尔马林固定4 h以上就可以很好的保存抗原。②脱钙:脱钙良好才能切出完整的组织，采用Schriddle 氏脱钙液［2］(甲醛10 ml、蒸馏水90 ml、硝酸20 ml)脱钙2 ～3 h，既有固定作用又有脱钙作用。在实际工作中，可以使用的脱钙液种类很多，无论使用哪种脱钙液，其目的是使脱钙彻底，抗原保存良好。骨髓组织体积小，脱钙时间不宜久，只要掌握好脱钙时间，都能达到满意效果。③漂片及烤片:设定常用漂片水温为40 ℃，烤片温度为60 ℃。各实验室可根据工作经验调整，建议温度不能高，避免组织松散，抗原扩散、破坏。④免疫组化染色组织封边:利用骨髓活检组织石蜡连片做免疫组化染色，在滴加一抗前，一定要甩干切片上的多余水分后再用韧性好、吸水性强的纸擦干组织之间的水分，起到组织的封边作用。只要做好这一步骤，就能避免在滴加一抗过程中出现抗体的外溢、融合，导致对染色结果的误判。于兰等［3］等运用唇膏封片法取得较好效果，但只能在短期起到阻水的效果，不能长久保留免疫组化液体不外溢;PAP 笔使用方便、效果稳定，但价格昂贵、消耗大;谢秋红等［4，5］用指甲油封边，购买方便、价格低廉，但在封边时会有少许有害气体挥发;徐明堂等［6］用自行设计的防溢液画蜡笔进行封边，有效避免了抗体液及其他染色的干扰，在使用过程中注意及时断电，避免烫伤。

利用组织芯片技术做免疫组化染色，具有体积小、信息含量高的优点，并且可以根据不同的需要设计、组合出不同的受体蜡块，主要适用于抗体测试、免疫组化染色的阳性/阴性对照［7］、室内质控［8］、DNA、RNA 原位杂交［9］，具有省时、经济、信息量大等优点，但费用昂贵、构建组织微阵列相对复杂，难以普及推广。近年来，部分医院尝试用免疫组化双染技术在同一张组织切片上同时显示两种不同抗原的表达，取得满意效果，其优点是可以明确两种抗体在同一细胞或组织内的相互关系，缺点是若两种抗原共存于同一细胞的胞质或胞核中，镜下显示的两种染色颜色重叠，遇到这种情况就需要再分别做一下两种抗体的染色［10］，使操作变得繁琐、诊断报告延迟。

根据我院病例情况，在做免疫组化染色时选择的常用抗体为:MPO、TdT、CD45、CD38、CD138、CD68、CD20、CD79а、CD3、CD45RO、CD61、CD117、CD34、Ⅷ因子、ki-67 及肿瘤相关抗原，这些常用抗体对确认骨髓中未成熟细胞群的谱系和肿瘤的分型有很大帮助［11］。我科在一张裱有骨髓活检石蜡连片的玻片上同时进行多种不同抗体的染色，有效地诊断了淋巴造血组织疾病及肿瘤63 例，包括慢性粒细胞白血病15 例、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤6 例、多发性骨髓瘤7 例、急性淋巴细胞白血病3 例、淋巴瘤累及骨髓4 例、急性髓系白血病10 例、骨髓纤维化6 例、血小板增多症1 例、再生障碍性贫血2 例、骨髓增生异常综合症9 例。

采用骨髓活检石蜡连片进行多种免疫组化染色，操作方法简单、效果稳定，具有可重复性。同样的方法，还应用于内镜组织、穿刺活检组织，同样能取得满意效果。

［1］陈辉树.骨髓病理学［M］.北京:人民军医出版社，2010:264.

［2］龚志锦，詹镕洲.病理组织制片和染色技术［M］.上海:上海科学技术出版社，1994:283.

［3］于兰，何松，陈亚丽.介绍一种免疫组化封边法［J］.临床与实验病理学杂志，2009，25(2):36.

［4］谢秋红，孟奎，周晓军.指甲油替代免疫组织化学PAP 笔的使用方法［J］.临床与实验病理学杂志，2002，18(2):184.

［5］苏俊芳，钟子键，何彦丽，等.多种封边法在免疫组化染色中应用比较［J］.诊断病理学杂志，2007，14(5):365.

［6］徐明堂，杜传国，吕翠环，等.防溢液画蜡笔的制作和使用［J］.河北医药，2001，23(2):109.

［7］王翠芝，周小鸽，黄受芳，等.组织芯片在免疫组化染色阳性对照中的应用［J］.临床与实验病理学杂志，2006，22(4):481-483.

［8］赵丽平，苏宏昌.“套餐式”组织芯片方法在免疫组化室内质控中的应用［J］.临床与实验病理学杂志，2012，28(1):106.

［9］孔廷谊，孔令非. 自制组织微阵列在自动免疫组化染色中应用［J］.临床与实验病理学杂志，2012，28(5):586.

［10］刘洪博，刘艳彩，张新丽，等. 免疫组化双染技术在淋巴瘤亚型检测中的应用［J］. 临床与实验病理学杂志，2012，28(10):1178.

［11］Juan Rosai. ROSAI＆ACKERMAN 外科病理学［M］. 回允中，主译.北京:北京大学医学出版社，2006:2050.