培养基灭菌程序的验证

2013-12-23于学珍

生物技术世界 2013年9期

关键词：平皿灭菌器马丁

于学珍

(烟台正海生物技术有限公司山东烟台 264006)

培养基应采用验证合格的灭菌程序灭菌。应对高压灭菌器的蒸汽循环系统进行验证,确保在一定装载方式下的正常热分布。本实验就是验证灭菌器的灭菌程序,通过检查培养基的灵敏度及无菌性来验证灭菌程序。

1 材料与仪器

1.1 仪器设备(表1)

1.2 用具

培养皿,三角瓶,移液管,接种针,试管。

1.3 培养基

营养琼脂培养基(110112)、玫瑰红钠琼脂培养基(1112222)、硫乙醇酸盐流体培养基(111114)、营养肉汤培养基(111015)、改良马丁培养基 (1111242)、改良马丁琼脂培养基(110910)(北京三药科技开发公司)。

1.4 试剂

0.9%无菌氯化钠溶液。

1.5 菌种

培养基灵敏度检查所用的菌种传代次数不得超过5代。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003];大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102];枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501];白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001];黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]嗜热脂肪杆菌(ATCC7953)(含菌量:5×105-5×106cfu/片)。

1.6 菌液制备

接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中,30～35℃培养18-24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中,23～28℃培养24～48h。将培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数50～100cfu(菌落形成单位)的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中,23～28℃培养5～7d,加入0.9%无菌氯化钠溶液3～5mL,洗脱孢子。然后,用管口装有薄的无菌棉花或纱布,能过滤菌丝的无菌毛细吸管吸出孢子悬液至无菌试管内,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含孢子50～100cfu的孢子悬液[2]。具体稀释、计数操作如下。

取1mL培养物或孢子悬液加入0.9%无菌氯化钠溶液9mL中,摇匀,即得10-1菌悬液,取其lmL加入0.9%无菌氯化钠溶液9mL中,摇匀,即得l0-2菌悬液。依此类推,制得10-3,10-4,10-5,10-6,10-7菌悬液。分别吸取10-4,10-5或10-6,10-7菌悬液各1mL加入平皿中,倒入营养琼脂或改良马丁琼脂培养基,凝固后倒置培养。每个稀释级分别制备2个平行平板。白色念珠菌、黑曲霉培养72h计数;大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌培养48h计数。每种菌均用每1mL含菌50～100cfu的稀释级做培养基灵敏度检查实验.

1.7 F0值计算

D121:121.1℃下生物指示剂的D值(本实验D121取值1.5)

A:微生物最初数量;B:微生物最终数量。若所有生物指示剂经灭菌实验后培养均呈阴性则:F0=1.5×lg(6×5×105)=10则证明现有灭菌工艺能够满足生产需要。若灭菌实验生物指示剂经培养后有呈现阳性者则实验结果不被接受,认为现有灭菌工艺不能满足生产需求,需更改灭菌条件。121℃饱和蒸汽条件下存活时间≥3.9min,杀灭时间≤19min,D=1.5-3.0。