田向楠 田斌* 张雪娟 周知里 马焕成

(西南林业大学国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室 云南昆明 650224)

木棉(Bombax ceiba L.)别名红棉、攀枝花、英雄树等,为木棉科(Bombacaceae)木棉属落叶高大乔木,主要生长在热带及亚热带地区,具有很高的观赏、药用、经济价值。目前,国内外对木棉的研究主要集中于木棉的传粉生物学、组织培养、化学成分分析、纤维理化性质等方面。有关遗传多样性及种质资源鉴定等方面的研究报道相对较少。

图1:4种方法提取的木棉基因组DNA电泳图谱

图2:改良后的4种方法提取木棉基因组DNA的电泳图谱

近年来随着分子生物学的快速发展,基因工程和分子标记等分子生物技术已广泛应用于植物的种植资源鉴定及遗传多样性分析等方面。而高质量的DNA是进行后续分子生物学实验的保障。目前提取植物DNA的方法主要有CTAB法、SDS法、高盐低PH法、以及基于试剂盒的膜吸附法和磁珠法等。研究者需根据研究材料的特点和实验目的优化DNA提取方法。因此本文通过8种不同的DNA提取方法对其进行总DNA提取,并对所提取的DNA纯度和产率等方面进行分析对比,以得出最优的木棉基因组DNA的提取方法,为今后的分子生物学研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料

供试材料为硅胶干燥后的成熟木棉叶片,于2012年9月份分别取自普洱市耿马县(北纬23°12′;东经101°08′),怒江州泸水县(北纬25°85′;东经98°85′)。

1.1.2 主要仪器、试剂

主要仪器:自动电热压力蒸汽灭菌锅,电子天平,磨样机,恒温水浴锅,低温离心机,凝胶成像系统,电泳仪,NanoDrop 2000微量紫外-分光光度计,冰箱。

主要试剂:(1)预处理液:1.4mol/L NaC1；20mmol/L EDTA；100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)；0.2%β-巯基乙醇,混合后最终调至pH为8.0,高压灭菌。(2)CTAB提取缓冲液:2%CTAB；1.4mol/L NaCl；20mmol/L EDTA,100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)；0.2%β-巯基乙醇混合后最终调至pH为8.0,高压灭菌。(3)SDS提取缓冲液:1mol/L Tris-HCl(pH8.0),20mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl,1.5% SDS,高压灭菌。(4)TE:10mmol/L Tris-HCl(pH=8.0),0.1mmol/L EDTA。(5)CI:v(氯仿):v(异戊醇)=24:1。(6)v(酚):v(氯仿):v(异戊醇)=25:24:1。(7)75%乙醇及无水乙醇。

1.2 DNA提取方法

称取0.02g硅胶干燥的木棉叶片于2mL离心管中,加入少量的PVP粉及两颗钢珠,在干样磨样机上充分研磨2min左右,使之完全成为细粉。随后运用不同的提取方法提取总DNA。

1.2.1 传统的CTAB法

传统的CTAB法参照Clark等的方法提取。

1.2.2 传统的SDS法

参照王景雪等的方法提取。

1.2.3 普通基因组DNA抽提试剂盒(膜吸附法)

普通试剂盒为Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(产品编号:SK8262),提取方法步骤参照说明书进行。

1.2.4 磁珠基因组DNA抽提试剂盒

磁珠法基因组DNA抽提试剂盒(产品编号:SK8732),提取方法步骤参照说明书进行。

1.2.5 改良的普通基因组DNA抽提试剂盒(膜吸附法)

普通试剂盒为Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(产品编号:SK8262),提取方法为:首先用预处理液将材料处理,之后参照使用说明书进行。

1.2.6 改良的磁珠基因组DNA抽提试剂盒

改良的磁珠法基因组DNA抽提试剂盒(产品编号:SK8732),提取方法为:首先用预处理液将材料处理,之后参照使用说明书进行。

1.2.7 改良的CTAB法

(1)加入1000μL 65℃预热的处理液,使之充分混匀,4℃12000r/min离心机离心10min使之分层,倒掉上清液。(2)加入800μ L 65℃预热的CTAB,3μL β-巯基乙醇,在65℃水浴锅中预热40-60min,期间轻轻摇匀几次。(3)加入等体积的酚:氯仿:异戊醇,缓慢反转离心管10min,使内含物充分混匀后并成乳浊液,在4℃12000r/min离心机上离心10min使之分层,取上清液,转入1.5mL离心管中。(4)加入等体积氯仿:异戊醇,缓慢反转离心管10min,使内含物充分混匀后并成乳浊液,在4℃ 12000r/min离心机上离心10min使之分层,取上清液,转入1.5mL离心管中。(5)重复第4步。(6)在抽提的上清液中加入其2/3体积的-20℃预冷的异丙醇,轻轻摇匀离心管,放入-20℃冰箱内沉淀40min。(7)4℃ 12000r/min离心机上离心8min,弃上清液,用600μL 75%乙醇清洗沉淀,4℃12000r/min离心8min,重复此步骤一次。(8)用600μL无水乙醇清洗沉淀,4℃12000r/min离心8min,倒掉液体。(9)然后将沉淀至于温室下自然风干。(10)自然风干后,加入100μL TE缓冲液。

1.2.8 改良的SDS法

(1)加入1000μL 65℃预热的处理液,使之充分混匀,4℃12000r/min离心机离心10min使之分层,倒掉上清液。(2)加入1000μL 65℃预热的SDS提取液,加入100μL 5mol/L KAc (pH 4.8),加入10 μL β-巯基乙醇,少量PVP粉,充分混匀后于65℃水浴30min。4℃12000r/min离心10min,吸上清液。(3)加入等体积的酚:氯仿:异戊醇,缓慢反转离心管10min,使内含物充分混匀后并成乳浊液,在4℃12000r/min离心机上离心10min使之分层,取上清液,转入1.5mL离心管中。(4)加入等体积氯仿:异戊醇,缓慢反转离心管10min,使内含物充分混匀后并成乳浊液,在4℃ 12000r/min离心机上离心10min使之分层,取上清液,转入1.5mL离心管中。(5)重复第4步。(6)在抽提的上清液中加入其2/3体积的-20℃预冷的异丙醇,轻轻摇匀离心管,放入-20℃冰箱内沉淀40min。(7)4℃ 12000r/min离心机上离心8min,弃上清液,用600μL 75%乙醇清洗沉淀,4℃ 12000r/min离心8min,重复此步骤一次。(8)用600μL无水乙醇清洗沉淀,4℃12000r/min离心8min,倒掉液体。(9)然后将沉淀至于温室下自然风干。(10)自然风干后,加入100μL TE缓冲液。

1.3 DNA的含量检测

1.3.1 电泳检测

取DNA样品4μL与2μL 6×Loading buffer混匀后上样,1×TAE电泳缓冲液,8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,2000bp Marker 6μL,120V电泳20min,电泳结束后,在凝胶成像系统下观察照相。

1.3.2 DNA纯度与质量浓度检测

用NanoDrop2000微量紫外-分光光度计测定样品液的纯度及质量浓度。

2 结果与分析

2.1 紫外分光光度计测定

分别将8种不同方法提取的木棉DNA样品在紫外分光光度计下测量其产率及A260/A280的比值,可以得出木棉基因组DNA质量浓度:改良的CTAB法>改良的磁珠法试剂盒>磁珠法试剂盒>普通试剂盒法>改良的普通试剂盒法>改良的SDS法>CTAB法>SDS法；除改良的普通试剂盒DNA产率下降外,其余三种方法CTAB法,SDS法及磁珠法试剂盒经过改良后DNA产率都有所提高且CTAB法十分显著。就其A260/A280的比值可以得出DNA的纯度:改良的磁珠法试剂盒>改良的普通试剂盒法>磁珠法试剂盒>改良的CTAB法>普通试剂盒法>改良的SDS法>CTAB法>SDS法。此外,经过改良后DNA纯度都有所提高,且CTAB法和SDS法比较明显,经改良后的磁珠法试剂盒A260/A280的平均比值为1.93在1.8-2.0之间纯度较高,其余方法均在1.8以下,存留蛋白质多糖等次生代谢物质。综合DNA得率及纯度比较分析可以得出:改良的磁珠法试剂盒提取的木棉基因组DNA效果最佳。

2.2 八种方法提取木棉基因组DNA的电泳检测结果

从8种方法提取DNA的琼脂糖电泳图谱(图1)可以看出,常规CTAB法和常规SDS法均有严重的拖带现象,且点样孔有残留物,DNA条带不清晰甚至没有。普通试剂盒与磁珠法试剂盒DNA主带比较清晰,无拖带现象,但点样空有轻微的残留物。从电泳图谱(图2)可以看出除改良的SDS法DNA主带不清晰,其余三种改良的CTAB法、改良的普通试剂盒法及改良的磁珠试剂盒法DNA主带清晰,无拖带现象。改良的CTAB法与改良的普通试剂盒法点样空仍有少量杂质,而改良的磁珠法试剂盒点样空干净无杂质。

3 结语

由于木棉叶片中含有大量的多糖、多酚、萜类等物质,能成功地从木棉材料中提取高质量DNA的关键是如何有效的去除多糖、蛋白质及一些次生物质。采用常规的CTAB法、SDS法、及试剂盒均得不到较高质量的基因组DNA。CTAB法、SDS法、普通试剂盒及磁珠法试剂盒经过改良处理后DNA的综合质量均得到了提高。并且能用于下游分子生物学实验。这是由于在植物细胞中,生物膜将细胞不同部位隔离开形成不同区室,多酚、多糖及萜类等次生物质主要存在于细胞质中,所以在裂解细胞核前,先对其进行预处理,先将细胞破碎以除去细胞质中的多糖多酚及萜类等次生物质。并在细胞核裂解前加入少量的PVP粉,可与酚类物质结合形成水不溶性的复合物,同时也能与多糖结合,进一步去除预处理后余留的多酚多糖等杂质。

本研究表明,改良后的CTAB法、普通试剂盒及磁珠法试剂盒均得到了较高质量的DNA。但各有其优缺点,改良后的CTAB法为一种较为经济的植物总DNA提取方法,但其耗时较长,所用药品中的苯酚、氯仿等对人体毒性很大,并且纯度不够高有少量的杂质。改良后的普通试剂盒其操作简单,耗时少,其纯度要比改良的CTAB法高,但其产率却偏低。改良的磁珠法试剂盒无论提取纯度、得率都为最好,其具有独特分离作用的磁珠和缓冲液系统,从样品中分离纯化高质量核酸,特殊包被的磁珠,在一定条件下对目的核酸具有很强的亲和力,而当条件改变时,磁珠释放吸附的核酸,能够达到快速分离纯化核酸的目的。整个过程不涉及有毒试剂,安全、便利、提取的核酸纯度高、质量可靠。但缺点是其费用较高。各实验室可以根据自己的实验要求及条件选择最适合的DNA提取方法。

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