杨 艳 瞿明仁 欧阳克蕙 赵向辉 易中华 宋小珍

(1.江西农业大学动物科学技术学院，南昌 330045;2.江西省畜牧技术推广站，南昌 330077)

近年来，由于动物生长性能和集约化程度的不断提高，现代反刍动物生产中开始大量使用高比例精料的饲粮，以提高牛、羊生产水平和生产效率，但是，这往往导致动物采食量下降、瘤胃菌群失调、瘤胃酸中毒等。乳酸是瘤胃碳水化合物代谢过程中的一种中间产物，瘤胃内乳酸浓度的高低是瘤胃功能正常与否的一个重要指标。反刍动物瘤胃内乳酸浓度显著升高是导致急性瘤胃酸中毒、瘤胃炎、肝水肿等代谢疾病的直接原因。患急性瘤胃酸中毒的病畜可观察到瘤胃乳酸浓度由小于5 mmol/L 急剧上升到 50 ～120 mmol/L［1］，严重酸中毒时甚至超过300 mmol/L［2］。烟酸是动物必需营养素之一，是生物细胞氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的合成前体。一般情况下，反刍动物摄入与瘤胃合成的烟酸量足够满足其营养需要，一般不需要额外补充。但随着“高精料短周期”肥育模式的推广，反刍动物对烟酸等B族维生素的需求也越来越大［3－4］。NAD+是细胞生物化学过程中重要的辅因子，对生物体内多种生物代谢起重要的调控作用。那么在高精料饲粮条件下，精料比及烟酸对锦江黄牛瘤胃酸代谢是否有影响，影响的机制如何，目前尚不清楚，也鲜见报道。因此，本试验对高精料饲粮条件下，添加烟酸对瘤胃乳酸及挥发性脂肪酸产生的影响进行研究，旨在探讨瘤胃酸中毒新的调控思路和方法，减少酸中毒所造成的巨大经济损失，促进反刍动物养殖业的发展。

1 材料与方法

1.1 试验动物、设计及饲粮

选用3头平均体重为(275±20)kg、安装有永久性瘤胃瘘管的锦江黄牛，采用精料比例逐步提高来诱导酸中毒的试验方法。试验分4期，每期10 d，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期依次饲喂精料比例分别为60%、70%、80%的饲粮，研究不同精料比例对锦江黄牛瘤胃乳酸及挥发性脂肪酸浓度的影响;第Ⅳ期研究在精料比例为80%的饲粮条件下，添加烟酸对瘤胃乳酸及挥发性脂肪酸浓度的影响。试验动物每日饲喂2次(07:00和19:00)，自由饮水。

烟酸购于郑州兴禾化工有限公司，食品级，纯度大于98%。烟酸添加量为800 mg/kg(根据欧阳克蕙等［5］研究报道确定)。试验饲粮参照我国肉牛饲养标准(NY/T 815—2004)［6］设计，其组成及营养水平见表1。

表1 试验饲粮组成及营养水平Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets %

1.2 样品的采集及预处理

每期最后3 d(13:00)采集样品。分别在瘤胃高、中、低3点采集瘤胃液各50 mL，每头牛分别取样分装。取1 mL瘤胃液，12 000 r/min离心5 min，去掉上清液，添加 300 μL HCl(0.2 mol/L)，萃取NAD+，破坏掉 NADH，50℃水浴10 min，然后迅速放在冰中冷却至0℃，接着逐滴添加300 μL NaOH(0.1 mol/L)进行中和，1 mL 枪头反复吹打混匀，12 000 r/min离心10 min，将上清液移至另一管中待用，－80℃保存用于NAD+浓度的测定;另取1 mL瘤胃液，12 000 r/min离心5 min，去掉上清液，以300 μL NaOH(0.2 mol/L)萃取 NADH，添加300 μL HCl(0.1 mol/L)进行中和，其余步骤同NAD+，－80℃保存用于NADH浓度的测定［7］。

其余瘤胃液经4层消毒纱布过滤。取100 mL滤液迅速转移至100 mL离心管中，1 500 r/min离心10 min，去除原虫和饲料大颗粒后快速分装，－80℃保存，以备测定挥发性脂肪酸、乳酸及丙酮酸浓度;另取10 mL滤液，6 mL立即测定总脱氢酶活性，剩余4 mL滤液4℃冷藏，12 h内测定乳酸脱氢酶活性。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 pH

瘤胃液采集后，充分混合，采用PHS－320型pH计立即测定pH。

1.3.2 挥发性脂肪酸浓度

采用气相色谱法测定:杭州科晓GC－1690型气相色谱仪，氢火焰离子化(FID)检测器，OV－1701通用型毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm×0.5μm)，2000色谱数据工作站，内标物为巴豆酸。采用程序升温:初温80℃，初时3.5 min，升速30℃/min，终温180℃，终时10 min;进样室温度260℃，检测器温度260℃;柱前压力0.05 MPa，氮气作为载气。样品进样量1μL。

1.3.3 丙酮酸、乳酸浓度及乳酸脱氢酶活性

采用TU－1810D型紫外可见分光光度计检测，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.4 NAD+、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)浓度

参照李骆冰等［8］的方法。反应混合液:0.1 mol/L Bicine buffer(pH 8.0)2 mL、无水乙醇75 μL、12 mmol/L 噻 唑 蓝 (MTT)100 μL、16.6 mmol/L乙硫吩嗪(PES)200 μL 混合，30 ℃水浴10 min。反应体系:依次添加50μL样品、2 mL的反应混合液和20μL的乙醇脱氢酶(500 U/mL)，迅速混匀，测定。

标准曲线的制作:利用紫外可见分光光度计测定并得到标样反应液在570 nm吸光度(A570nm)随时间变化曲线，15 min内吸光度变化与时间成正比。试验中取测定时间为7 min。绘制5个已知浓度标样的A570nm随时间变化曲线斜率图，对每个标样试验点进行线性拟合，得到该标准浓度下A570nm随时间变化曲线的斜率。以A570nm随时间变化曲线斜率为横坐标，以标准样品浓度为纵坐标作图，得到NAD+(或NADH)的标准曲线图。

样品测定:将样品的A570nm随时间变化曲线的斜率值代入标准曲线，得出相应的浓度值。

1.3.5 总脱氢酶活性

参照哈兹耶夫［9］的方法。对照管首先加入5 mL异丙醇，然后在对照管和样品管各加入100目尼龙布过滤的新鲜瘤胃液2 mL及0.2 mL 1.5%的氯化三苯四氮唑(TTC)混匀。混匀后立即将对照管和样品管放在厌氧条件下恒温39℃水浴中准确反应10 min。样品管迅速加入5 mL异丙醇终止反应。3 min后将对照管和样品管的反应液以4 000 r/min离心10 min。上清液稀释15倍，于紫外可见分光光度计在485 nm处比色测吸光度(A485nm)。将在38.5℃、pH 6.8条件下，每分钟引起测定液吸光度上升0.1的酶量定义为1个酶活单位。

1.4 统计分析

试验数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法进行多重比较，结果以平均值±标准误表示，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 烟酸对瘤胃酸代谢的影响

由表2可知，在试验第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期，未添加烟酸的情况下，随着精料比例的提高，瘤胃pH显著下降(P＜0.05);瘤胃中的乙酸、丙酸、丁酸、总挥发性脂肪酸浓度随着精料比例的提高而提高，70%、80%精料比例与60%精料比例之间差异显著(P＜0.05)，但70%和80%精料比例之间差异不显著(P＞0.05);而瘤胃中的丙酮酸、乳酸浓度及乳酸/丙酮酸也随着精料比例的提高而提高，60%与70%精料比例之间差异不显著(P＞0.05)，80%精料比例与60%、70%精料比例之间差异显著(P ＜0.05)。

在试验第Ⅲ、Ⅳ期，精料比例为80%条件下，与未添加烟酸相比，添加烟酸显著提高了瘤胃pH及丙酸、总挥发性脂肪酸浓度(P＜0.05)，显著降低了丙酮酸、乳酸浓度及乳酸/丙酮酸(P＜0.05)，而乙酸、丁酸浓度及乙酸/丙酸差异不显著(P＞0.05)。

表2 烟酸对瘤胃酸代谢的影响Table 2 Effects of nicotinic acid on acid metabolism of rumen

2.2 烟酸对瘤胃中NAD+(H)浓度及与酸代谢有关酶活性的影响

由表3可知，在试验第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期，未添加烟酸的情况下，各精料比例对瘤胃中NAD+浓度无显著差异(P＞0.05)，但有随着精料比例的提高而降低的趋势;总脱氢酶活性随着精料比例的提高而显著降低(P＜0.05)。各精料比例对瘤胃中NADH浓度、NADH/NAD+无显著影响(P＞0.05)，但有随着精料比例的提高而提高的趋势。

在试验第Ⅲ、Ⅳ期，精料比例为80%条件下，与未添加烟酸相比，添加烟酸对瘤胃中NAD+、NADH浓度、NADH/NAD+、总脱氢酶活性均无显著影响(P＞0.05)，但有提高 NAD+浓度，降低NADH浓度及NADH/NAD+的趋势。

第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ期瘤胃中均未检出乳酸脱氢酶活性，而在试验第Ⅲ期，精料比例为80%(未添加烟酸)条件下，瘤胃中检出了乳酸脱氢酶，其活性为132.9 U/mL。

3 讨论

3.1 精料比例对瘤胃酸代谢的影响

在试验第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期，未添加烟酸的情况下，随着精料比例的提高，瘤胃pH显著下降;瘤胃中的乙酸、丙酸、丁酸、总挥发性脂肪酸浓度随着精料比例的提高而提高，70%、80%精料比例与60%精料比例之间差异显著，但70%和80%精料比例之间差异不显著。而瘤胃中的乳酸浓度及乳酸/丙酮酸也随着精料比例的提高而提高，60%与70%精料比例之间差异不显著，80%精料比例与60%、70%精料比例之间差异显著。可见，瘤胃pH的显著下降，主要是由于乳酸大量产生而导致的。同时，随着精料比例的提高，60%、70%和80%精料比例使瘤胃中NADH浓度、NADH/NAD+有提高的趋势，NAD+浓度有降低的趋势。这可能是因为随着精料比例的提高，饲粮中丰富的淀粉和糖类被瘤胃内各种微生物所降解，生成葡萄糖、果糖、木糖等己糖和戊糖，然后经酵解转化为丙酮酸，同时大量的 NAD+还原成 NADH，NADH/NAD+升高，促使了瘤胃乳酸产量的增加和乳酸/丙酮酸升高，这也说明了乳酸是瘤胃pH显著下降的主要原因。因此，高精料饲粮对瘤胃酸代谢具有显著影响，主要是使乳酸大量产生。如果长时间使用高精料饲粮具有酸中毒的危险。

表3 烟酸对瘤胃中NAD+(H)浓度及与酸代谢有关酶活性的影响Table 3 Effects of nicotinic acid on NAD+(H)concentrations and acid metabolism-related enzyme activities in rumen

3.2 烟酸对瘤胃酸代谢的影响

烟酸是动物必需营养素之一。一般情况下，反刍动物摄入与瘤胃合成的烟酸量足够满足其营养需要，不需要额外补充。但随着动物生产性能的提高和饲粮结构的改变，对烟酸等B族维生素的需求也越来越大。有研究认为，烟酸有利于缓解反刍动物的高精料应激［3－4］。本研究结果表明，80%精料比例条件下，与未添加烟酸相比，添加烟酸显著提高瘤胃pH，抑制了因精料比例提高而pH进一步下降，使瘤胃pH保持在正常范围内。乳酸的酸度比挥发性脂肪酸高数十倍［10］，乳酸浓度升高可导致瘤胃pH迅速降低，本试验条件下，添加烟酸使乳酸浓度、乳酸/丙酮酸显著降低。因此，添加烟酸具有缓解瘤胃酸应激的作用。Brent等［3］报道，补饲烟酸有益于受到应激刺激的公牛，尤其是那些采食高精料饲粮有不良应激反应的公牛。Byers等［4］总结了14个试验，发现肉牛饲粮中添加50～250 mg/kg烟酸可促进育肥家畜尽快适应育肥期饲粮，显著提高平均日增重与饲料利用率。Niehoff等［11］研究表明烟酸的使用效果和基础饲粮中精料比例有关。当基础饲粮中精料比例为80%时，添加烟酸才有效。当饲粮中粗饲料含量达到50%时，添加烟酸效果不佳。这可能与低精料比例饲粮条件下，乳酸产生量小有关。

3.3 烟酸对瘤胃NAD+(H)浓度及乳酸脱氢酶活性的影响

烟酸是动物体内NAD+的直接前体，与碳水化合物代谢和乳酸的产生密切相关。乳酸脱氢酶是催化生成乳酸的关键酶，瘤胃内乳酸脱氢酶的活性反映了瘤胃的乳酸产生能力。NAD+是NADH的竞争性抑制剂，对乳酸脱氢酶有抑制作用。本研究结果表明，当未添加烟酸的情况下，由于饲粮精料比例的提高，消耗NAD+，使瘤胃中NAD+浓度下降，NADH浓度提高，而添加烟酸后则相反，NAD+浓度提高，NADH浓度下降。值得注意的是试验第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ期均未检出乳酸脱氢酶，原因可能是检测方法不够灵敏，但不代表这3个试验期瘤胃中没有乳酸脱氢酶，而在试验第Ⅲ期，精料比例为80%(未添加烟酸)的条件下，瘤胃中检出了乳酸脱氢酶，其活性为132.9 U/mL，同时，其乳酸浓度也是4个试验期中最大的，为1.184 mmol/L。这可能是在精料比例80%没有添加烟酸时，NAD+浓度下降，降低其对乳酸脱氢酶的抑制作用，使乳酸脱氢酶活性大幅度升高，达到了本方法检测的灵敏度。本研究结果与Krause等［12］、Russell等［13］研究结果相似。

4 结论

添加烟酸提高了瘤胃 NAD+浓度，降低了NADH浓度及NADH/NAD+，抑制了乳酸脱氢酶活性和乳酸产生，从而缓解瘤胃酸应激或酸中毒。

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