司道文 杨 鹏 郭艳华 孙敬宇 赵金芝 罗晓燕 程 勇 栗占营 李 云

(河北联合大学基础医学院 河北唐山 063000;①唐山市丰润区人民医院;②开滦总医院;③河北大学附属医院)

脑水肿是创伤性脑损伤(Traumatic brain injury，TBI)后继发性损伤的重要病理生理过程。脑损伤后炎症反应引起血管通透性的改变和血脑屏障的功能障碍，最终导致脑水肿的发生［1］。环氧化酶-2(Cyclooxygenase，COX-2)是花生四烯酸代谢初始步骤中的关键限速酶，在脑损伤后的炎症反应和脑水肿中扮演重要的角色［2］。孕酮(Progesterone，PROG)也称为黄体酮，是天然的孕激素，目前临床主要用于保护妊娠及妇科疾病的治疗。近年来，孕酮对脑损伤后神经细胞的保护作用逐渐受到重视［3］。孕酮对脑水肿的影响已经有报道［4］，但是对孕酮降低脑水肿的机制尚不明确。由于炎症反应是引起脑水肿的重要因素，而且COX-2是重要的炎症因子。因此，本实验拟建立大鼠脑损伤模型，利用免疫组织化学方法检测大鼠脑组织COX-2表达，探讨孕酮降低脑水肿的机制。

1 材料与方法

1．1 实验动物与分组 成年雄性SD大鼠144只，体质量250～300g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，以标准饲料喂养。按随机化原则分为4组，即假手术组(Sham group)、脑损伤组(TBI group)、安慰剂组(Vehicle group)和孕酮治疗组(PROG group)，每组36只大鼠，均设3个时间点:6h、24h和72h。每个时间点12只大鼠，分别用于COX-2免疫组织化学检测和脑水肿测定。

1．2 动物模型建立 采用Feeney’s自由落体硬脑膜外撞击方法建立模型。大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉，在矢状缝后1．5mm，中线旁2．5mm处打开一直径5mm骨窗，用40g的击锤从25cm处自由坠落冲击撞杆造成脑损伤。假手术组仅切开头皮，开同样大小骨窗而不造成脑挫伤。孕酮(Sigma公司)溶于22．5%2-羟丙基-β-环糊精(2-hydroxypropy-p-cyclodextrin，HBC)中，孕酮治疗组伤后1h、6h腹腔注射孕酮16mg/kg，以后每天1次皮下注射。安慰剂组在相同时相注射等量HBC溶液。

1．3 免疫组织化学检测 分别于伤后各时间点，对大鼠脑组织取材固定，自视交叉后用恒冷箱切片机连续冠状切片，片厚10 μm，贴附于载玻片上待用。COX-2(Cayman公司)免疫组化检测采用SP法，严格按照试剂盒说明进行操作。采用CMIAS真彩色医学图像免疫组化自动分析系统进行阳性细胞计数。切片在400倍光镜下观察，随机取5个视野，计数阳性细胞数，以平均值代表各区计数结果。

1．4 脑组织含水量测定 于各时间点，大鼠断头后快速剥离全脑，距伤灶周围2mm处取出脑组织，精密电子分析天平测其湿重，然后放入110℃烤箱烘烤24 h，，取出后冷却10 min后称干重，按下面公式计算:脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1．5 统计学处理 所有数据用(x±s)表示，采用 SPSS 16．0统计软件进行数据统计处理，各组间比较采用方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义;两变量间关系分析采用线性相关分析，P＜0．05表示有统计学意义。

2 结果

2．1 孕酮对脑损伤后COX-2表达的影响 假手术组COX-2在各个时间点表达较低;脑损伤组和安慰剂组伤灶周围皮质可见大量COX-2阳性细胞的表达;孕酮治疗组脑损伤周围皮质COX-2表达明显减少，与脑损伤组和安慰剂组比较，差异有统计学意义(P＜0．05)，见表 1。

表1 孕酮对脑损伤后各个时间点COX-2表达的影响(n=6，x±s)

2．2 孕酮对脑损伤后脑水肿的影响 脑损伤组和安慰剂组脑组织含水量明显增多;孕酮治疗后，脑组织含水量显著减少，与脑损伤组和安慰剂比较，差异有统计学意义(P＜0．05)，见表2。同时脑损伤后脑组织含水量与COX-2表达存在正相关关系(r=0．683，P＜0．05)。

表2 孕酮对脑损伤后各个时间点脑水肿的影响(%，x±s)

3 讨论

近年来，随着我国的经济社会的高速发展，因交通事故、社会治安及生产事故等原因而引起的脑外伤患者逐年增多，现在脑损伤已经成为常见病［5］。脑损伤后炎症反应在继发性损伤中具有重要作用。脑损伤后，通过胶质细胞增生，巨噬细胞和中性粒细胞浸润，激活释放细胞介质和炎性因子，从而诱发和加重血管源性和细胞毒性脑水肿。炎性因子COX-2在脑水肿的发病过程中具有重要作用。COX-2催化代谢的过程中产生大量的氧自由基，氧自由基可引起脂质过氧化，引起细胞膜损伤等，可增加血脑屏障的通透性，加剧脑水肿。另外，近年来研究表明，脑损伤后COX-2与iNOS在相同的时间点表达，并且NO可增强COX-2的催化活性，产生自由基;而COX-2的催化产物氧自由基又可促进NO毒性作用，两者相互作用加重的脑损伤和脑水肿的发生［6］。本实验研究发现，COX-2在脑损伤组和安慰剂组6h有少量表达，24h达到高峰，72h仍高于正常水平，与Strauss等［7］用原位杂交技术检测脑损伤COX-2mRNA表达规律一致。而孕酮干预组，在各个时间点COX-2表达均降低，表明孕酮可以降低脑损伤后脑内的炎症反应。对脑水肿的检测发现，脑组织含水量在外伤后显著增加;而给予孕酮后，在各个时间点脑水肿明显降低;而且COX-2的表达与脑水肿呈正相关，表明孕酮可能通过抑制炎症反应而降低脑水肿的发生。

孕酮是近年发现的一种非常具有潜力的脑保护药物［8］，具有多效性。由于颅脑创伤是一个复杂的病理生理学过程，如谷氨酸水平升高、细胞内钙离子超载、氧自由基生成增加、炎性反应增强，以及细胞凋亡与修复、基因及蛋白质表达改变等;而孕酮可以针对脑损伤后的多个环节发挥作用，这也正是以往脑创伤后，针对单一病理因素治疗不能取得良好效果的原因［9］。孕酮可以通过基因机制和非基因机制发挥脑保护作用［10］，调节GABA和NMDA受体活性，而且最近发现mPRα受体可能在介导炎症和水肿方面具有重要作用［11］。目前在不同的模型和种属以及不同的实验室，均得到了孕酮对脑损伤安全性和有效性的证据［12］，它的潜在治疗价值越来越受到认可。

［1］ Kumar A，Loane DJ．Neuroinflammation after traumatic brain injury:opportunities for therapeutic intervention［J］．Brain Behav Immun，2012，26(8):1191

［2］ Kunz T，Marklund N，Hillered L，et al．Cyclooxygenase-2，prostaglandin synthases，and prostaglandin H2 metabolism in traumatic brain injury in the rat［J］．J Neurotrauma，2002，19(9):1051

［3］ Stein DG．Progesterone exerts neuroprotective effects after brain injury［J］．Brain Res Rev，2008，57(2):386

［4］ Shahrokhi N，Khaksari M，Soltani Z，et al．Effect of sex steroid hormones on brain edema，intracranial pressure，and neurologic outcomes after traumatic brain injury［J］．Can J Physiol Pharmacol，2010，88(4):414

［5］ 殷丽楠，李建民，赵雅宁，等．额叶和颞叶创伤性颅脑损伤患者执行功能的评价［J］．河北联合大学学报(医学版)，2012，14(4):456

［6］ Kim SS，Kong PJ，Kim BS，et al．Inhibitory action of minocycline on lipopolysaccharide-induced release of nitric oxide and prostaglandin E2 in BV2 microglial cells［J］．Arch Pharm Res，2004，27(3):314

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［8］ 司道文，程爱国，阚志生，等．孕酮的脑损伤保护作用及其机制［J］．华北煤炭医学院学报，2005，7(4):436

［9］ 李东亮．孕酮用于脑外伤及脑卒中的研究进展［J］．新乡医学院学报，2012，29(1):1

［10］ Cooke PS，Nanjappa MK，Yang Z，et al．Therapeutic effects of progesterone and its metabolites in traumatic brain injury may involve nonclassical signaling mechanisms［J］．Front Neurosci，2013，7:108

［11］ Meffre D，Labombarda F，Delespierre B，et al．Distribution of membrane progesterone receptor alpha in the male mouse and rat brain and its regulation after traumatic brain injury［J］．Neuroscience，2013，231:111

［12］ Kaore SN，Langade DK，Yadav VK，et al．Novel actions of progesterone:what we know today and what will be the scenario in the future［J］．J Pharm Pharmacol，2012，64(8):1040