黄略略，乔 方，方长发，张树飞，马 炜

(深圳职业技术学院，应用化学与生物技术学院，广东深圳518055)

怀枝属于较晚熟荔枝品种，成熟期一般在7月上旬，主要分布在广东和广西两个省份，尤以广东最多。怀枝果实产量高，亩产最高可达1000kg，果肉晶莹多汁，鲜品售价较低，是适合深加工的荔枝品种。冷冻干燥是目前生产高档荔枝干的主要方法，冻干荔枝色泽白亮，口感松脆，但在后期贮藏过程中，发现37℃条件下，1个星期左右荔枝干就发生变色;25℃条件下，10d左右荔枝干也发生明显变色［1］;而在4℃条件下，放置1年左右荔枝干颜色几乎没有变化。虽然低温冷藏可以保持冻干荔枝的外观色泽不变化，但成本增加，若能使冻干荔枝在常温下贮藏而颜色不变将有助于降低运营成本，扩大冻干荔枝的销售。荔枝果肉中存在两种与颜色变化有关的酶，过氧化物酶和多酚氧化酶［2-4］。在不采取抑制酶活预处理的条件下，仅靠干制不会使酶失活，因此在没有前处理的冻干荔枝中仍然存在两种酶活。国内外关于抑制酶活的研究很多，方法也较为广泛，如超高压处理［5］、高压脉冲电场处理［6］、超声波协同处理［7］、微波处理［8］、抑制剂浸泡处理、热烫处理等，其中应用最广泛的是热烫处理和抑制剂浸泡处理，热烫处理能够彻底使酶失活，但对原料品质破坏较大，结和抑制剂、微波、超声波等处理可以缩短热烫时间或降低热烫温度，从而更够更好地保持原料的营养成分及质构，这些协同灭酶方法也因此受到了更多的关注。本文的目的是寻找有效的抑制酶活的方法，使果肉中的两种酶全部被抑制，从而为贮藏期的变色研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荔枝 品种为怀枝，采自深圳西丽果场，采摘后冷却，然后置于-25℃冻库中存放，冷冻荔枝用于测定前处理过程中的酶活，经前处理后的冻干荔枝用于测定色差和质构;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、愈创木酚、过氧化氢、邻苯二酚、硫酸铵、谷胱甘肽、抗坏血酸、氢氧化钠 均为分析纯试剂。

冷冻离心机 德国eppendorf 5810 R;手持糖度计 日本ATAGO公司PAL-1;分析研磨机 IKA A11;分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司722N;色差计 美国hunter lab colorflex;物性分析仪

美国Food Technology Corporation公司TMS-PRO;真空干燥箱 上海智城分析仪器制造有限公司ZKD-A6270;冻干机 深圳艾斯兰德冷机制造有限公司VL-2W。

1.2 实验方法

1.2.1 谷胱甘肽浸泡处理 将怀枝去皮去核后，果肉一分为二，采用1mmol/L的谷胱甘肽溶液浸泡怀枝果肉，浸泡时间为 5、10、15、20、30min。浸泡之后沥干表面水分迅速进行1.2.5的操作。

1.2.2 谷胱甘肽、抗坏血酸真空浸泡处理 将怀枝去皮去核后，果肉一分为二，将果肉分别放入1mmol/L的谷胱甘肽溶液和1mmol/L的抗坏血酸溶液中，然后放入真空干燥箱中进行抽真空处理，真空度为0.08Mpa，处理时间分别为 5、10、15、20、30min。取出后沥干表面水分迅速进行1.2.5的操作。

1.2.3 热烫处理 将怀枝果肉在90℃的热水中进行热烫，处理时间为1、3、5、10min。取出之后立即用纯水进行冷却降温，接着沥干表面水分进行1.2.5的操作。

1.2.4 谷胱甘肽和抗坏血酸溶液热烫处理 配制不同浓度的谷胱甘肽和抗坏血酸溶液，将溶液加热至90℃，放入怀枝果肉，处理时间分别为 1、3、5、10min。取出之后立即用纯水进行冷却降温，接着沥干表面水分进行1.2.5的操作。

1.2.5 怀枝果肉PPO及POD的制备 取适量的怀枝果肉浸入液氮中，待完全冷冻后取出，用分析研磨机将其果肉打碎，准确称取10g左右的果肉，用0.1mol/L pH7.0的磷酸缓冲液在4℃下浸提1h，随后用两层纱布过滤至离心管中，4℃ 8000r/min离心15min，上清液即为粗酶液［9］。向粗酶液中添加40%饱和度的固体硫酸铵，静置1h后再次在4℃下8000r/min离心15min，弃上清液。沉淀用0.1mol/L pH7.0的磷酸缓冲液溶解，并以同样的缓冲液透析过夜，透析液在4℃下8000r/min离心15min，取上清液，即得PPO和POD提取液。

1.2.6 PPO活性测定 参照刘春丽等［9］的方法进行测定。测定反应体系包括1mL 0.1mol/L的邻苯二酚，1.9mL 0.05mol/L的磷酸缓冲液和0.1mL酶液，在398nm下测定吸光度值。从酶液加入开始计时，每30s记录一次OD值，以最初的直线段斜率计算酶活。1个酶活单位定义为在测定条件下，吸光度值每分钟增大0.001所需的酶量。酶活平行测定三次。

式中:D-稀释倍数;FW-样品鲜重(g)。

1.2.7 POD活性测定 参照刘春丽［10］的方法进行测定。反应体系包括2.4mL 0.1mol/L pH7.0的磷酸缓冲液，0.1mL 1%的过氧化氢，0.4mL 1%的愈创木酚和0.1mL的酶液，在470nm下测定吸光度值的变化。每10s记录一次，测定2min内的OD值的变化。1个酶活单位定义为在测定条件下，吸光度值每分钟增大0.001所需的酶量。酶活平行测定三次。

式中:D-稀释倍数;FW-样品鲜重(g)。

1.2.8 冻干荔枝的色差及脆度测定 将荔枝果肉放置于托盘中，在-35℃的冻库中进行速冻，待荔枝果肉的中心温度达-25℃后，再速冻1～2h，然后将荔枝连同托盘一起放入冷冻干燥机中，冷阱温度为-50℃，加热板温度为最高设定为50℃［11］。总干燥时间为18～20h。

将冻干后的样品先放置在-25℃的冻库中冷冻一段时间，避免样品因温度过高而变粘。取出后用分析研磨机打碎，样品倒入透明的测量杯中，进行测定、读数。颜色通过L(亮度/暗度)、a(红度/绿度)、b(黄度/蓝度)表示［12］。每个样品重复五次。

采用FTC公司的TMS-Pro物性分析仪对冻干后荔枝的脆度进行测定［13-14］。测定时，荔枝果肉中心向下放置，测试探头选择直径为25mm的圆柱形探头。测定条件为:起始力0.3N，检测前速度50mm/mim，检测速度100mm/min，下压距离为8mm。最大断裂力可以反映样品的脆度，单位是牛顿(N)。

1.2.9 数据分析 实验数据用SPSS 11.5软件进行分析，ANOVA程序用于方差分析，Bivariate程序用于组间相关性分析。当p≤0.05时认为平均值之间有显著差异。

2 结果与分析

2.1 抑制剂浸泡对两种酶活性的影响

经多位研究人员实验证实，谷胱甘肽和抗坏血酸是多酚氧化酶和过氧化物酶的有效抑制剂［10，15-16］。本实验中，先采用最有效的抑制剂谷胱甘肽对荔枝进行浸泡，浓度为1mmol/L。浸泡对两种酶活性的影响见图1和图2。

图1 不同浸泡处理对荔枝果肉中PPO活性的影响Fig.1 Effect of soaking treatment on PPO activity in lychee pulp

从图1和图2中可以看出，谷胱甘肽浸泡可以降低PPO和POD的活性，在浸泡15min之内，随着浸泡时间的延长，PPO和POD的活性显著下降，但再延长时间，PPO活性之间并无显著差异。一般来说，酶活性降至原来的5%以下，可以认为酶失活。而谷胱甘肽浸泡不能使怀枝荔枝果肉中的PPO和POD失活。这可能是由于浸泡只能抑制荔枝果肉表面的酶活，而很难对内部的果肉起作用，即使延长时间，抑制剂也很难渗透至整个果肉。实验对0.5、2mmol/L的谷胱甘肽溶液也进行了抑制酶活测定，残余酶活有所不同但并无显著差别，因此未在文章中列出。

图2 不同浸泡处理对荔枝果肉中POD活性的影响Fig.2 Effect of soaking treatment on POD activity in lychee pulp

因此，实验选择真空浸泡来处理怀枝果肉。真空浸泡对酶活性的影响结果见图1和图2。从图中可以看出，谷胱甘肽真空浸泡15min之后，PPO和POD活性显著低于常压浸泡(p＜0.05)，但同样不能使酶失活。抗坏血酸溶液真空浸泡可以显著降低PPO的活性，而对POD活性的影响较小。总的来说，谷胱甘肽和抗坏血酸真空浸泡同样不能使酶失活。这主要是因为荔枝的果肉结构并不是由一个个细胞组成的，所以即使是真空环境，抑制剂溶液也很难渗透至整个果肉。实验对0.5、3、5mmol/L的抗坏血酸溶液也进行了抑制酶活测定，残余酶活并无显著差别，因此同样未在文章中列出。

2.2 热烫对两种酶活性的影响

热烫是最常用也最实用的前处理方法。但对于荔枝来说，还没有对其进行热烫研究的。实验采用90℃热烫来处理怀枝果肉，热烫对酶活的影响见图3。

图3 90℃不同热烫时间对两种酶活性的影响Fig.3 Effect of blanching time on PPO and POD activities at 90℃

从图3可以看出，POD的活性先随着时间的延长而降低，后保持不变。当热烫时间达3min时，POD的活性已降至鲜样的5%以下了，说明90℃ 3min可以使POD失活。但对于PPO来说，热烫时间10min之后，活性为鲜样的23.46%，与热烫3min之后并无显著差别(p＞0.05)。在实验中，还测试了热烫20min后的PPO活性，其数值仍与热烫3min之后的残余酶活接近。这表明怀枝荔枝果肉中的PPO非常耐热，单纯的热烫处理很难使怀枝果肉中的PPO失活，这与刘春丽等［2］的研究结果是一致的。

2.3 抑制剂和热烫联合处理对两种酶活性的影响

由上述讨论可知，抑制剂浸泡和单纯热烫均不能使PPO失活，而90℃热烫3min就可以使POD失活，因此，考虑如何使荔枝果肉中的PPO失活是预处理的关键。采用抑制剂和热烫联合，考察不同浓度的抑制剂热烫对荔枝果肉中的PPO的影响。实验结果见图4和图5。

图4 不同浓度的谷胱甘肽溶液90℃热烫对PPO活性的影响Fig.4 Effect of glutathione solution on PPO activity at 90℃

图5 不同浓度的抗坏血酸溶液90℃热烫对PPO活性的影响Fig.5 Effect of ascorbic acid solution on PPO activity at 90℃

由图4可知，随着谷胱甘肽溶液浓度的增大，PPO的活性不断的降低。当谷胱甘肽溶液浓度达到3.0mmol/L时，残余酶活仍大于10%，这意味着PPO并未失活。如果继续提高谷胱甘肽溶液的浓度，可能PPO活性会进一步降低，但谷胱甘肽作为一种酶的抑制剂，其价格远高于普通的抑制剂，从成本上来说，继续提高其溶液浓度不是合理的选择。

从图5可以看出，随着抗坏血酸溶液浓度的增大，PPO的活性不断的降低。当抗坏血酸溶液浓度达到0.3%，热烫时间达3min以上时，残余酶活低于5%，表明PPO的活性被很好的抑制。因此，可以采用0.3%的抗坏血酸溶液在90℃至少热烫3min来抑制荔枝果肉的酶活。孙月娥等［17］研究发现，采用0.3%的柠檬酸和0.07%的抗坏血酸溶液在75℃下热烫3min可以很好的抑制金针菇中的PPO活性，可见抑制剂和热烫结合确实是有效地抑制PPO活性的方法。

2.4 热烫对冻干怀枝荔枝品质的影响

2.4.1 热烫对冻干怀枝荔枝色泽的影响 热烫对冻干后怀枝的色泽的影响见表1。从表1中可知，未漂烫的荔枝果肉与不同漂烫时间的荔枝果肉的L值之间无明显差异，a值只与漂烫10min的冻干样品之间存在明显差异，b值显著高于所有漂烫冻干样品，这表明未漂烫样品黄色的程度要高，事实上，这个现象在实验中可以清楚的看到，未漂烫的冻干荔枝表面明显偏黄色，这很可能是由于干制前荔枝的酶促褐变导致的。虽然热烫1min并没有完全使酶失活，但热烫之后立即进行速冻和干制，抑制了酶的活性，因此热烫过的样品之间b值无显著差异。表1中的数值是冻干之后未经贮藏测得的，贮藏期间的颜色变化需要通过进一步的贮藏实验进行研究。

表1 90℃不同漂烫时间对冻干后荔枝颜色的影响Table 1 Effect of blanching time on color of freeze dried lychee pulp

2.4.2 热烫对冻干怀枝荔枝脆度的影响 热烫之后的荔枝果肉更容易冻干，这可能是由于热烫使荔枝果肉的结构更松散。通过物性仪的测定，冻干荔枝果肉的脆度结果见图6所示。从图中可明显看出，热烫1、3min的样品与对照组荔枝脆度之间无显著差异，而热烫5、10min的荔枝样品的断裂力明显低于对照样，断裂力越小，说明样品脆度越大，因此热烫5min及以上可以明显增加冻干怀枝荔枝的脆度。

图6 不同热烫时间对冻干后怀枝荔枝果肉脆度的影响Fig.6 Effect of blanching time on crispness of freeze dried lychee pulp

3 结论与讨论

1.0mmol/L的谷胱甘肽和抗坏血酸用于浸泡和真空浸泡怀枝果肉均不能使酶失活;90℃热烫3min以上能够使POD的活性降至原来的5%以下;采用0.3%的抗坏血酸溶液在90℃热烫3min可以使PPO失活。热烫使冻干后的荔枝色泽更白;最佳的预处理工艺为0.3%的抗坏血酸溶液在90℃热烫5min。

PPO和POD是不是冻干荔枝干在贮藏过程变色的原因，有待于进一步的贮藏实验。在贮藏过程过测定和比较预处理和未经预处理样品色泽的变化并测定酶活及其它指标，分析冻干荔枝变色的真正原因。

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