廖勇，黄建林，阎洪涛，董丹丹，蒋建春

（1.四川省医学科学院·四川省人民医院泌尿外科，成都610072；2.四川省医学科学院·四川省人民医院病理科，成都610072；3.成都中医药大学，成都610075）

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系常见的恶性肿瘤之一，其生物学行为表现较复杂。肿瘤血管是恶性肿瘤生长、转移的基础，微血管密度（MVD）常用来评价肿瘤的血管生成，而血管内皮生长因子（VEGF）可调控血管的生成，其表达与 MVD存在相关性。α－甲酰基辅酶A消旋酶（P504S）是一种新近确认的特异性分子标记物，在许多肿瘤如前列腺癌、RCC、结肠癌、乳腺癌等都有较高的表达，可能与肿瘤的发生、发展存在密切关系。本研究应用免疫组织化学标记菌葡萄糖聚合物（labeled dextran polymer，LDP）法对RCC组织中P504S、VEGF的表达及MVD进行了观察比较，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

2003年1月～2010年12月于四川省人民医院泌尿外科行手术且病理证实为RCC的患者67例，患者中位年龄48.1岁（25～69岁），其中男42例，女25例。所有病例术前均未接受化疗、放疗和免疫治疗。按WHO1997年病理学分级标准：G1级17例，G2级39例，G3级11例；按2002年AJCC的 TNM 分期标准：I期（T1）16例，Ⅱ期（T2）21例，Ⅲ（T3）19例，Ⅳ期（T4）11例。手术后对患者进行随访，随访年限1～7年，其中有完整随访资料的患者共57例。对照组为10例因肾外伤等原因行肾脏手术的成年患者，标本为切除的非肿瘤肾组织。

1.2 病理方法

所有病理标本均用15%甲醛液浸泡、固定，常规取材、脱水和石蜡包埋，连续4μm厚切片备染。分别进行常规HE染色、免疫组化P504S、VEGF和CD34染色。一抗分别为兔抗人P504S多克隆抗体（福州迈新公司产品）、单克隆抗体VEGF（工作浓度1∶100，Zymed公司产品）、抗CD34单克隆抗体（工作浓度1∶50，DAKO公司产品），二抗均为EnvisionTM检测系统（DAKO公司产品）。采用免疫组织化学LDP法进行检测。阳性对照采用已知的阳性切片，阴性对照采用PBS液代替一抗。

1.3 结果判断标准

1.3.1 P504S染色 阳性为细胞质着色。分级标准：阳性肿瘤细胞＜5%为（－），5%～25%为（＋），26%～50%（＋＋），＞50%为（＋＋＋）。

1.3.2 VEGF染色 阳性表达为肿瘤细胞浆出现棕黄色反应物。以染色强度和阳性细胞百分率得分之和判定VEGF的表达强度：总分0～3为低表达，4～6为高表达。其中1）染色强度：阴性为0，弱阳性为1，阳性为2，强阳性为3；2）阳性细胞百分率：阳性细胞0%为0，＜25%为1，26%～50%为2，＞50%为3。

1.3.3 MVD评估 采用CD34染色，阳性为任何血管内皮细胞（包括单个内皮细胞）的细胞核和／或细胞浆和／或细胞膜中出现棕黄色染色。评估MVD分两步，先将CD34染色的切片置于低倍镜下（×100）观察，确认血管数最高的区域；然后随机选择5个微血管密集区域于高倍显微镜下（×400）观察，并记录微血管数（MVC），取其平均值即为MVD值，数据用均数±标准差（±s）表示。

1.4 统计学方法

运用SPSS 17.0软件进行统计分析。两组均数比较采用t检验，多组均数比较及计数资料采用方差分析和χ2检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P504S在RCC及正常肾组织中的表达

P504S呈弥漫胞质阳性，在正常肾组织的近曲小管和远曲小管表达，而集合管和肾小球为阴性。其中仅1例呈阳性表达，且为弱阳性。P504S在67例RCC组织中有44例呈阳性表达，P504S在RCC与正常肾组织中表达差异有统计学意义（P＜0.01）（见表1）。

表1 RCC与正常肾组织中P504S的表达［n（%）］

2.2 VEGF的表达和RCC MVD分布

67例RCC组织中VEGF阳性表达与10例正常肾组织比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。67例RCC的平均MVD为（52.75±12.76），10例正常肾组织为（15.63±6.32），前者明显较高，差异有统计学意义（P＜0.01）。从形态分布上看，RCC微血管呈网状、管状散在或弥漫性，而正常肾组织微血管形态及分布相对均匀、规范。此外，不同区域MVD也不相同，在肿瘤间质和肿瘤组织边缘部血管丰富，而在肿瘤中央近坏死区域，血管分布稀疏或者缺如（见表2）。

表2 RCC与正常肾组织中VEGF的表达［n（%）］和MVD

2.3 P504S表达与VEGF的表达及MVD的关系

P504S表达与VEGF表达、肿瘤MVD之间存在正相关性，P504S阳性表达组（n＝44）：VEGF阳性表达38例，阴性表达6例，MVD值为（58.61±21.37）；而P504S阴性表达组（n＝23）：VEGF阳性表达14例，阴性表达9例，MVD值为（31.25±16.43）。两组比较差异均有统计学意义（VEGF阳性表达率比较P＝0.017，MVD值比较P＜0.01）（见表3）。

表3 P504S阳性表达与阴性表达中VEGF的表达［n（%）］和MVD

2.4 P504S、VEGF和 MVD与RCC临床、病理学特点的相关性

按肿瘤不同级别进行分组比较P504S的表达，G1级与G2级、G1级与G3级、G2级与G3级比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。按分期比较，高分期组（T3～T4期）P504S表达明显高于低分期组（T1～T2期），差异有统计学意义（P＜0.01）。可见，RCC组织中P504S的表达水平与RCC的病理分级和临床分期均呈正相关。

分析结果表示：各组之间比较，VEGF表达的差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。组织学Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组每两组之间 MVD比较，差异均有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01）；临床分期各组之间 MVD比较，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。所以，VEGF的表达与RCC MVD两者皆与RCC病理分级、临床分期有密切关系。

P504S、VEGF的表达与RCC的MVD三者还与RCC有无远处转移或淋巴结转移有关：有远处转移组（n＝6）MVD为（89.27±22.14），VEGF低表达0例，高表达6例，P504S低表达0例，高表达6例；无远处转移组（n＝61）MVD为（40.13±19.23），VEGF低表达29例，高表达32例，P504S低表达38例，高表达23例，P＜0.01。有淋巴结转移组（n＝13）MVD为（82.72±19.73），VEGF低表达1例，高表达12例，P504S低表达0例，高表达13例；无淋巴结转移组（n＝54）MVD为（39.13±17.12），VEGF低表达28例，高表达26例，P504S低表达32例，高表达22例，P＜0.01（见表4）。

2.5 P504S、VEGF和MVD与RCC预后的关系

对有完整随访资料的患者研究表明：随访5年内死亡者P504S、VEGF和MVD的表达均高于存活5年以上者，两者比较，差异有统计学意义P＜0.01（见表5）。

表4 P504S、VEGF和MVD与RCC临床病理学特点的相关性

表5 P504S、VEGF、MVD与术后生存时间的关系

3 讨论

3.1 P504S在RCC中表达的意义

P504S基因定位于染色体5p13，全长1 621bp，编码382个氨基酸，具有在肿瘤组织中特异性表达的特点。P504S是一种新近确认的特异性分子标记物，存在于胞浆内过氧化物酶体和线粒体上，目前学者［1］认为P504S可能与肿瘤的发生、发展存在密切关系。P504S一般在正常组织中无表达，当细胞突变成肿瘤细胞时，细胞内的代谢也发生了变化，在有关基因的调控下该蛋白产物过度表达，致P504S出现阳性。据文献［2，3］报道，结直肠癌、肝细胞癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、肾腺癌等肿瘤组织中均有阳性表达，在肿瘤的临床病理诊断中起重要的作用，且与肿瘤的生物学行为及预后有关。

在正常肾组织，P504S表达于近曲小管和远曲小管，呈弱至中等程度阳性。本实验中RCC组织中P504S阳性表达率达65.67%，且多呈中等和强阳性表达，提示多数RCC中有β氧化酶大量增加。本研究还发现，P504S的阳性表达与RCC的临床分期和肿瘤细胞的分化程度均呈现正相关性。而在10例正常肾组织中仅1例呈弱阳性表达，证实P504S对RCC较敏感。因此，P504S可作为RCC诊断和鉴别诊断的重要参考指标。此外，随访资料显示P504S阳性表达率低的患者术后生存期明显高于阳性表达率高的患者，说明P504S标记物对RCC患者的预后也有一定参考价值。

3.2 VEGF在RCC中表达的意义

肿瘤的血管新生是肿瘤发生发展过程中不可或缺的一个重要环节，已成为许多肿瘤的研究热点，它包括肿瘤细胞诱导的毛细血管形成以及肿瘤组织中血液循环建立的复杂过程［4］。而新生血管的形成又受多种因子的调控，包括血管生长因子和血管生成抑制因子，其中VEGF的作用尤为突出，它对血管内皮细胞的增殖、迁移和血管构建有较强的调控作用，有研究［5］证实其与肿瘤的分级、分期及预后有关。VEGF是一种典型的外分泌蛋白，它可以与血管内皮细胞的膜受体结合，从而发挥相关功能，而肿瘤组织能继续生长和转移的必要内在条件之一就是肿瘤组织中VEGF的高表达。本研究显示VEGF低表达组的MVD值低于高表达组（P＜0.01），该结果与上述理论是一致的。

本研究结果还显示，RCC组织中VEGF的表达强度随RCC病理分级的增高而升高（P＜0.01），说明VEGF的表达与RCC的肿瘤细胞分化程度密切相关；此外，VEGF的表达强度也随RCC临床分期的增高升高（P＜0.01），说明VEGF的表达强度与肿瘤的侵袭能力也相关。所以临床上可将RCC组织中VEGF的表达程度作为一个判断RCC恶性程度和侵袭能力的指标。

3.3 检测RCC组织中MVD的临床意义

人体正常组织血管的增殖受机体严格调节，而肿瘤的血管增殖往往是无法控制的［6］，其中最重要的就是微血管（microvessel，MV）的形成。MV包括组织中的微动脉、微静脉及毛细血管。肿瘤组织中新生的MV发育不成熟，管壁仅为一层常有裂隙的内皮细胞，缺乏基底膜；内皮细胞分泌的纤维蛋白溶解酶又可破坏基质屏障，使肿瘤细胞容易进入MV，经血循环在远处器官形成转移灶，所以肿瘤MV是肿瘤血行转移的重要因素［7］。计数原发肿瘤中瘤内MV数是目前最常使用的量化肿瘤血管生成的方法，而CD34是标记血管内皮细胞特异性最高的标记抗原，检测MVD多采用CD34染色，本研究也采用此法。

目前研究认为，随着MVD的增加，肿瘤侵袭能力也会增加；更有学者［7］认为，MV侵犯和血管新生可作为一项预测RCC恶性程度及预后的指标。本研究中以CD34标记MV发现，RCC组织中MV形态和数量各异，密度分布也不均匀；RCC组织中的MVD明显高于正常肾组织的MVD，差异有统计学意义（P＜0.01）。其次，随着肿瘤组织学分级和肿瘤临床分期的增高，RCC中MVD也随之升高，表明RCC中MVD与肿瘤的恶性程度及其侵袭能力呈正相关性。此外，RCC的MVD与局部淋巴结转移或远处转移密切相关，这些结果均与文献报道相似。

3.4 P504S表达与VEGF表达及MVD的相关性和临床意义

本研究结果显示，RCC组织中P504S的表达与VEGF表达及MVD均呈正相关性，表明VEGF在肾癌中是血管生成调控的关键促血管生成因子［8］。新生血管的形成对肿瘤增殖不可缺少，因为其保证了肿瘤代谢的需求。因此，当RCC中VEGF的过表达将导致肿瘤间质MVD增高这一结果，必将导致肿瘤细胞内的代谢也发生变化，致多数RCC中有β氧化酶大量增加，即在有关基因的调控下使P504S蛋白产物过度表达，P504S出现阳性表达。

RCC的生物学行为表现较复杂，在临床上也难以准确预测其预后。本研究中采用免疫组化LDP对RCC组织中P504S、VEGF及 MVD进行了检测，同时探讨了P504S及VEGF、MVD与RCC预后的关系。随访结果发现5年内死亡者P504S表达、VEGF表达以及MVD测值均要高于存活5年以上者（P＜0.01），说明P504S、VEGF表达的强度及MVD数值的变化与RCC的恶性程度及预后密切相关。临床上通过检测RCC的P504S、VEGF表达和MVD，有助于判断肿瘤的恶性程度及预后特点。

综上所述，P504S、VEGF与 MVD均是反映RCC细胞生物学行为较理想的标记物，临床上联合检测可作为预测RCC恶性程度、转移及预后的一项重要参考指标。

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