赵 静，张红见，马梅琴，廖 明，陈 刚

（1.华南农业大学兽医学院 人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室，广东 广州510642；2.青海大学农牧学院，青海 西宁810016；3.青海大学昆仑学院，青海 西宁810600）

牛出血性败血症（HSC）是由多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，P.multocida）引起的，以高热、肺炎、间或呈现急性胃肠炎及内脏器官出血为特征的牛传染病，在青海省每年都季节性地散发和个别的群发，牦牛感染该菌后一般发病都比较急，病程较短，常常还未做出诊断便发生死亡，给养殖业造成了巨大的经济损失，是青海省重点防控的一类动物传染病，目前兽医临床对该病的诊断仍普遍采用传统的病原分离方法，不但复杂、费时，而且敏感性低；普通PCR技术虽然具有简便、快速、敏感和特异的优点［1－2］，但它易出现假阳性以及引起的实验室环境污染和染色剂具有致癌性等不足已引起学者们的注意。因此，建立简单、快速、特异和敏感的牦牛出血性败血症检测技术已迫在眉睫。

近年发展起来的实时荧光定量PCR技术将常规PCR技术与荧光检测相结合，其核酸扩增和检测都在同一反应管内进行，可以通过分析荧光信号判断反应结果，无需电泳检测，解决了PCR假阳性和核酸染料溴化乙锭对环境的污染问题［3］。由于荧光信号强度与扩增片段的数量成正比，还可以通过建立已知标准品的标准曲线对初始模板DNA进行准确定量，因此已成为检测病原体的重要方法［4－5］。但在所查文献中尚未见到以SYBR Green I染料为荧光指示剂的实时荧光定量RQ－PCR方法来检测牦牛多杀性巴氏杆菌的报道。已经证明［3］，KMT1基因是多杀性巴氏杆菌的种特异性基因，本研究参照GenBank中公布的KMT1基因的保守序列设计了一对引物，建立了以SYBR GreenⅠ染料为荧光指示剂的实时荧光定量RQ－PCR检测方法，以期为青藏高原牦牛出血性败血症的早期诊断及感染程度的定量分析提供技术支持。报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株 牦牛源、藏羊源、猪源和禽源多杀性巴氏杆菌分离株于2008年～2011年分离自青海省不同地区，具体信息见表1。肺炎克雷伯氏菌ATCC700603、大肠埃希氏菌ATCC25922、伤寒沙门菌ATCC 14028均由中国农业大学预防兽医学教研室馈赠。

表1 青藏高原动物多杀性巴氏杆菌分离株

1.2 引物的设计与合成 根据GenBank上公布的多杀性巴氏杆菌KMT1基因保守序列，采用Primer 5.0软件，设计合成了1对引物，引物序列为：上游引物5′－TGCTCGTTGTGAGTGGGCT－3′，下游引物5′－CGCTCTGTCGTTAATGGCTTC－3′，扩增长度为253 bp，由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.3 模板DNA的制备 挑取经分离培养、生化以及致病性试验鉴定为多杀性巴氏杆菌的分离株P0909单菌落于LB液体培养基（北京陆桥生物技术责任有限公司）中37℃振荡培养18～24h。用TaKaRa公司的细菌基因组DNA提取试剂盒抽提模板DNA，提取方法按说明书进行。

1.4 KMT1基因的PCR扩增 采用自行设计的KMT1引物，以抽提的DNA模板，进行PCR扩增。反应体系为：2×EasyTaq PCR Supermix 25 μL，上、下游引物1μL，模板DNA 1μL，ddH2O 22 μL，总体积50μL；反应条件：94℃ 5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。

1.5 阳性质粒标准品的制备 用天根生化科技（北京）有限公司生产的Easypure Quick Gel Extraction Kit回收1.4中的PCR产物，获得的253bp的目的基因片段与pEasyT1载体连接构建标准重组质粒，经PCR鉴定的阳性克隆菌液送上海英骏生物技术有限公司测序；取少量质粒标准品，用260nm紫外光测OD值，计算出标准品拷贝数为8.31×1010个拷贝／μL，然后将其稀释成1.0×1010个拷贝／μL质粒液，再依次作10倍稀释。

1.6 实时荧光定量RQ－PCR方法的建立

1.6.1 实时荧光定量RQ－PCR反应条件 PCR Master Mix 10μL，上、下游引物（25pmon／L）0.5 μL，10倍系列稀释的质粒标准品1μL，三蒸水20 μL，每个稀释度做3个重复，并做3个阴性水对照；反应条件：94℃5min；94℃30s，55℃20s，72℃32 s，40个循环；熔解曲线：95℃15s，60℃1min，95℃15s，1个循环。

1.6.2 标准曲线的建立 曲线以反应的Ct值为横坐标，以浓度（或拷贝数）为纵坐标，两者呈线性反比关系，绘制出一条标准曲线。

1.6.3 特异性和敏感性试验 用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RQ－PCR方法检测肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门菌以及经PCR鉴定的3株牦牛源、1株藏羊源、1株猪源、1株禽源多杀性巴氏杆菌，检验该方法的特异性；将1.0×1010个拷贝／μL P0909标准质粒做10倍系列稀释，在荧光定量PCR仪上检测，计算该方法所能检测到的最低拷贝数。

2 结果与分析

2.1 KMT1基因的PCR扩增 应用设计的引物对3株牦牛多杀性巴氏杆菌临床分离株Pm P0909、P0910、P1001进行PCR扩增试验（图1）。

图1 KMT1－1Forward／Reverse Primer对扩增产物电泳结果

对来自青海省祁连县的3株牦牛多杀性巴氏杆菌分离株应用KMT1－1上、下游引物进行普通PCR扩增，结果获得的目的片段大小为253bp，符合设计引物的扩增大小。回收目的片段，并与pEasy T1载体连接构建标准重组质粒，将双酶切鉴定阳性的质粒测序，测序结果与参考序列完全一致。

2.2 标准曲线的建立 以10倍系列稀释的标准质粒（1.0×100～1.0×1010拷贝／μL）做为模板，在荧光定量PCR仪上检测，得到标准曲线（见图2）。

图2 多杀性巴氏杆菌KMT－1基因SYBR GreenⅠ荧光定量RQ－PCR标准曲线

从构建的SYBR GreenⅠ荧光定量RQ－PCR标准曲线图可知获得的标准曲线相关系数R值为0.9998。

2.3 实时荧光定量RQ－PCR的特异性和敏感性试验 用建立的多杀性巴氏杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量RQ－PCR方法检测肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门菌等3株非巴氏杆菌菌株，结果肺炎克雷伯氏菌和伤寒沙门菌的波峰后移，形成的波峰与标准质粒的波峰有很大的差异，不能重合；而大肠埃希氏菌虽能形成于标准质粒相似的波峰，但是不能与标准质粒的波峰重合，而是波峰迁移，因此均为阴性（图3）。同时对经PCR鉴定的3株牦牛源、1株藏羊源、1株猪源、1株禽源多杀性巴氏杆菌进行检测，结果这6株多杀性巴氏杆菌的波峰与标准质粒的峰几乎完全重合（图4）。

将已经计算出拷贝数的阳性标准品按10倍稀释后，在荧光定量PCR仪上所能检测到的最低拷贝数为1.0×100，见图5。

图3 SYBR GreenⅠ荧光定量RQ－PCR的特异性试验

图4 SYBR GreenⅠ荧光定量RQ－PCR的特异性试验

3 讨论

3.1 牦牛出血性败血症每年给青海省所造成的经济损失十分巨大，有些地区已成为该病暴发的疫源地，已引起当地有关部门的高度重视。因此，改进检测技术对于预防和控制该病具有重要的意义。

3.2 根据所查文献，多以TaqMan探针荧光定量PCR方法检测沙门菌病、病毒病等［6－7］，还未见到以SYBR Green I染料为荧光指示剂的实时荧光定量RQ－PCR方法检测牦牛多杀性巴氏杆菌病的报道。通过本研究建立的荧光定量PCR检测方法对牦牛源、猪源、藏羊源和禽源等6株经PCR鉴定的菌株进行了检测，符合率为100%，同时用该方法检测肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门菌等3株非巴氏杆菌菌株，结果均不能与P0909标准质粒的波峰重合，而是发生了波峰迁移；此外，通过对经PCR鉴定的3株牦牛源、1株藏羊源、1株猪源、1株禽源多杀性巴氏杆菌进行检测，结果这6株多杀性巴氏杆菌的波峰与标准质粒的峰几乎完全重合；特别是与文献报道［8］的1对KMT－1引物相比，应用本试验设计的引物构建的标准曲线的相关系数值（0.999 8）优于文献报道的引物的相关系数值（0.993 7），在荧光定量PCR仪上所能检测到的最低拷贝数为1.0×100。表明本研究建立的检测方法特异性好，敏感性强。此外SYBR GreenⅠ荧光染料与探针相比，虽然特异性不如探针，但它能监测任何dsDNA序列的扩增，使检测方法变得简便，价格低廉，从而降低了检测的成本，特别适用于基层单位和边境检疫，具有广阔的应用前景。

图5 SYBR GreenⅠ荧光定量RQ－PCR的敏感性试验

3.3 根据溶解曲线分析，扩增产物中无引物二聚体的影响，说明所设计引物特异，退火温度合适，可为高原牦牛多杀性巴氏杆菌病的早期诊断、分子流行病学调查以及疫苗质量的监测等提供新的快速检测技术，并为以后研制快速诊断试剂盒奠定相关的理论基础。

3.4 据报道，荧光定量PCR可以对活体内隐性感染的核酸含量进行检测［9］，另外本试验使用的模板DNA均是用纯培养物提取的，是否可以用该方法直接对病料进行检测，是我们下一步将开展的研究。

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