赵 静，王 军，陈 洋，郑立双，孙城涛，吕文发

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春130118；2.辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁 锦州121001）

肌肉生成抑制素（MSTN）属转化生长因子－β（TGF－β）超家族成员，是骨骼肌发育的负调可溶性mystatin节因子［1－3］。在哺乳动物体内，MSTN 能够抑制肌细胞的增殖和分化［4－6］。目前有研究发现，受体、myostatin前肽、卵泡抑素及其相关多肽和蛋白质、myostatin阻断抗体、RNA干涉及其他一些化学抑制剂［2］，通过主动免疫方式抑制MSTN前体蛋白成熟化，从而抑制活性MSTN蛋白二聚体的形成，最终抑制MSTN的生物活性，从而导致肌肉的快速增长，但是有关体内MSTN生物学功能的调控机制目前还未阐明。蛋白质是细胞活性及功能的最终执行者，研究MSTN相互作用蛋白不仅对阐明MSTN的调控机制具有重要意义，而且也为开发MSTN功能调控技术和产品提供新的方向。酵母双杂交系统是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术，可以高通路的筛选细胞内相互作用蛋白，是发现相互作用新蛋白的一种强有力的手段［7，9］。本试验利用酵母双杂交技术对牛MSTN相互作用蛋白进行了筛选并应用免疫共沉淀技术对筛选蛋白进行体内验证，为阐明MSTN生物学功能的调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 大肠杆菌KC8，酵母菌Y2HGold，pGEX－4T－l和pcDNA 3.0－Flag载体均由本实验室保存；pGBKT7和pGADT7质粒、酵母双杂交系统Make Your Own“Mate ＆ Plate”Library System（Cat.No.630490）试剂盒，购自Clontech公司；酵母培养基所需各种氨基酸，购自美国Amresco公司；人胚胎肾细胞（293T）由本实验室保存，抗Flag标签的单克隆抗体偶联的琼脂糖凝胶珠（anti－Flag M2－Agarose）等，购自Sigma公司；转染试剂Lipofectmine2 000，购自Invitrogen公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 诱饵质粒的构建及自激活和毒性检测 根据GenBank上公布的牛MSTN成熟片段mRNA序列设计引物，上游引物引入ECORⅠ酶切位点：5′－TCGGAATTCGATTTTGGGCTTGATTGTGAT－GAAC－3′，下 游 引 物 引 入 PSTⅠ 酶 切 位 点：5′－CGCTGCAGTCATGAACACCCACAGCGATC－3′，对pMD18－T－MSTN重组载体和pGBKT7质粒进行双酶切，利用SolutionⅠ连接液定向连接，构建pGBKT7－MSTN诱饵质粒，对获得的重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序分析比对。将构建好的含诱饵载体pGBKT7－MSTN的Y2HGold酵母菌作为试验组，含载体pGBKT7－53的Y2H酵母菌作为阳性对照组，空Y2HGold酵母菌作为阴性对照组，涂布接种于 SD／－Trp－His、SD／－Trp－Leu、SD／－Trp／－Leu／－Ade／－His平板上，30℃倒置培养3～5d，观察菌落的生长情况。再分别将转有空载体pGBKT7的Y2H酵母菌和试验组接种于SD／－Trp的液体培养基中过夜振荡培养，用紫外分光光度计测量其OD600值。

1.3 牛肌肉cDNA文库的筛选 挑取在SD／－Trp固体培养基上生长大于2mm含有pGBKT7－MSTN质粒的Y2HGold酵母菌落，接种于SD／－Trp液体培养基中，30℃振荡培养16h～24h，当OD600值达到0.8时，与含有牛肌肉cDNA文库的Y187酵母菌交配融合，交配18h～24h后，观察交配情况，离心收集菌液，将菌液用玻璃珠涂布于SD／－Trp／－Leu／－His／－Ade平板上初步筛选阳性克隆，30℃倒置培养3～8d。同时取样品100μL梯度稀释浓度分别为：10－1、10－2、10－3、10－4；分别涂布在SD／－Trp，SD／－Leu，SD／－Trp－Leu平板上计算融合效率。

1.4 文库阳性克隆的鉴定分析 初步筛选的阳性克 隆 划 线 于 SD／－Trp／－Leu／－His／－Ade 平 板 上，30℃倒置培养3～8d。挑取生长旺盛的菌落进行PCR鉴定，将PCR鉴定成功的菌落接种于SD－Leu液体培养基中并提取质粒，将提取的质粒转化大肠杆菌KC8送上海生工生物工程技术服务有限公司测序并将质粒回转酵母验证，测序结果与NCBI数据库比对、分析。

1.5 免疫共沉淀 将293T细胞在37℃5%CO2培养箱中培养，待细胞长到90%～95%融合度时开始转染；在转染前1天，将细胞传代至直径6cm细胞培养板上。每孔加不含抗生素培养基DMEM 2 mL，将准备好的灭菌的盖玻片放入培养孔里，取构建成功的pLEGFP－MSTN 与pcDNA 3.0－Flag－T－cap重组质粒各5μg加入到250μL的DMEM（无血清、无抗生素）中为溶液1，再取同样的250μL的DMEM加入10μL lipofectamineTM2 000混匀，室温静置5min为溶液2，将溶液1和溶液2混合，室温条件下静置30min；将混合均匀的溶液1与溶液2逐滴加入孔中，轻轻混匀，于5%浓度的CO2培养箱中37℃条件下培养，6h后换液，继续培养18h～42 h；收细胞，用预冷的PBS洗2次，用1mL PBS悬浮细胞至1.5mL的离心管中，2 500r／min离心5 min，留上清；加500μL细胞裂解液裂解细胞；小探头超声细胞裂解液后，12 000r／min（4℃）离心10 min，取含相等量蛋白的上清加入25μL抗Flag标签的单克隆抗体偶联的琼脂糖凝胶珠悬液中，4℃缓慢摇晃孵育过夜，回收凝胶珠，再用裂解液洗涤3遍以上凝胶珠，在4℃条件下旋转孵育5h，3 000r／min（4℃）离心5min，将上清小心吸去，最终沉淀用20μL 2×SDS上样缓冲液悬浮煮沸10min，12 000 r／min离心1min。用抗GFP和Flag标签蛋白的两种单克隆抗体进行免疫印迹分析（Westem－blot）。

2 结果

2.1 诱饵质粒pGBKT7－MSTN构建及自激活和毒性检测分析 以pGBKT7－MSTN质粒为模板做PCR，并做双酶切获得7 600bp载体片段和330bp目的片段（见图1），送上海生工生物工程技术服务有限公司测序结果正确，表明pGBKT7－MSTN诱饵重组质粒构建成功。将含有诱饵质粒的pGBKT7－MSTN的 Y2HGold酵母菌 涂布在 SD／－Trp－His、SD／－Trp－Leu、SD／－Trp／－Leu／－Ada／－His平板培养基上都无菌落生长，且阳性对照组出现菌落，说明诱饵蛋白不能自激活。将试验组与转有空载体pGBKT7的Y2HGold酵母菌分别接种于SD／－Trp液体培养基中30℃振荡培养过夜后，OD600值分别为0.813和0.809无明显差别，说明构建的诱饵蛋白对宿主酵母菌无毒性。

2.2 阳性克隆筛选 酵母融合18h～20h后，取1滴菌液于载玻片上，置于倒置显微镜下观察细胞，酵母出现了三叶草状二倍体融合细胞，说明杂交融合成功。4个稀释度分别涂布接种于SD／－Trp、SD／－Leu、SD／－Trp／－Leu平板上，按照公式：融合率 ＝（SD／－Trp／－Leu菌落数）／（SD／－Trp和 SD／－Leu中较少的菌落数）计算融合率为16%，符合文库筛选要求。筛选出的阳性克隆在SD／－Leu／－Trp／－His／－Ade平板上反复筛选3次，得到3个阳性克隆，将这3个阳性克隆进行回转验证，得到一个阳性克隆（图2），再将得到的阳性克隆转入大肠杆菌中进行测序分析，与NCBI GenBank数据库进行BLAST比对，发现该基因与家牛titin－cap蛋白同源性高达99%，GenBank登录号为NM＿001014915.1。

图1 诱饵重组质粒pGBKT7－MSTN

图2 酵母双杂交分析阳性克隆

2.3 通过免疫共沉淀验证MSTN和T－cap在体内的相互作用 用抗Flag抗体偶联的琼脂糖珠子结合，免疫沉淀带有Flag标签的T－cap，再用GFP抗体做 Western－blot分析，检测免疫沉淀物中是否有GFP－MSTN。结果如图3，MSTN和T－cap可以在哺乳动物细胞中特异的结合，而GFP不会与T－cap结合。结果证明，MSTN和T－cap能够在哺乳动物细胞中特异的结合。

3 讨论

MSTN是近年来发现的一个重要的肌细胞生长调控因子，其主要功能是负向调控肌细胞生长发育，对该基因的进一步研究发现，有两种双肌牛骨骼肌中编码肌生成抑制素的遗传密码发生了突变［，9］，用基因打靶敲除GDF－8基因，制备了基因缺失小鼠，其骨骼肌的重量是普通小鼠的2～3倍以上［10］。因此通过抑制MSTN活性来增加畜禽肌肉量及在医学上的疾病治疗将是一个非常重要的研究。有研究发现，相互作用蛋白之间能够结合形成复合物，使某一蛋白处于非活性状态，因而从相互作用蛋白角度研究MSTN，能为MSTN生物学功能的调控打开新的思路。

酵母双杂交系统是研究蛋白质－蛋白质相互作用的一项有效技术，使用此种方法可以筛选与某一已知蛋白质或结构域发生相互作用的新成员。本研究利用酵母双杂交体系从牛肌肉cDNA中筛选与MSTN相互作用的蛋白，经2轮严格筛库，排除了假阳性，得到3个阳性克隆，经测序分析blast比对证实为1个基因，其余为相同序列或同源性较接近序列。本研究也通过免疫共沉淀技术对MSTN与T－cap进行相互作用验证，排除酵母双杂交存在的假阳性可能。

对筛选得到的MSTN相互作用蛋白进行功能分析，T－cap是一个19kDa的肌蛋白，最初被确定在骨骼肌中含量最为丰富［11］。据报道，T－cap在肌原纤维生成和肌纤维翻转过程中参与细胞骨架重组［12］，表明它在肌节蛋白的结构融合中起重要作用，是肌节的结构完整性所必要的［13］，有研究结果表明，T－cap在Z－拉链区域内起着连接肌原纤维与肌原纤维膜的作用［14］。MSTN蛋白以自分泌方式依赖剂量效应对肌纤维的增长分化起抑制作用。Zheng等［15］在C2C12成肌细胞中过度表达 T－cap蛋白，成肌细胞中 MSTN的浓度非常低，说明T－cap蛋白对MSTN起到一定的抑制作用。综上所述，本研究发现的T－cap蛋白能够抑制 MSTN功能，但这个蛋白是如何与MSTN发生相互作用，通过什么机制来发挥作用，还需进一步研究。

4 结论

本试验中，我们利用酵母双杂交技术筛选出与牛MSTN有相互作用的T－cap蛋白，并通过免疫共沉淀试验验证了二者之间存在相互作用，为探索MSTN蛋白功能和作用机理提供了新的方向。

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