马利青，韩秀敏，蔡其刚，郑 宜，陆 艳，王戈平，叶成玉，牛小迎

（1.青海省畜牧兽医科学院，青海 西宁810016；2.青海省地方病预防控制所，青海 西宁810007）

弓形虫病，是由龚地弓形虫（Toxophasmagondii）所引起的人畜共患病。虫体可以感染温血动物的许多属，包括人。动物通过吃了已经被猫科动物粪便污染的肉，或者通过母体传给胎儿的方式感染，未经加工的生肉也是造成该病在人群中传播的原因，同时手被猫粪便污染也是风险因素。估计在全世界约有1/3的人口中存在弓形虫的感染［1］。美国疾病控制和预防中心报道了从1999年到2004年的血清流行病学检测结果，血清阳性率为10.08%，处于分娩阶段的妇女的阳性率为11%左右（15岁～44岁）［2］。为了解弓形虫在青海省这样一个相对封闭的高海拔地区人群和不同动物之间的流行情况，我们于2010年5～10月份，利用ELISA诊断方法，对近期所收集的青海地区的孕妇、藏系绵羊、马、藏獒、骆驼、喜马拉雅旱獭、高原鼠兔、中华鼢鼠、藏羚羊和实验小鼠的血清样品进行检测，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 抗原 弓形虫的标准阴阳性血清由日本国家原生动物疾病研究控制中心提供，青海省畜牧科学院所生物技术研究室保存。重组的弓形虫表面融合蛋白（rSAG1），按照管刚等介绍的方法进行［3］。rSAG1简介如下：由基因编码的T.gondii表面蛋白1（SAG1）被克隆到pGEX－4T－3质粒上，再表达到Escherichiacoli（E.coli）上，最后获得rSAG1。

1.2 被检血清的采集和处理 1 090份被检血清分别来自孕妇的51份，藏系绵羊的220份，藏獒的192份，马的314份，骆驼的144份，喜马拉雅旱獭的68份，高原鼠兔的39份，中华鼢鼠的12份，藏羚羊的2份，实验小鼠的48份。采血时均空腹、颈静脉或心脏或眼眶眼底采集，采集后摆成斜面，置4℃冰箱5h后，放在室温待血清析出后收集血清，－20℃冷冻保存待检。

1.3 其他试剂和耗材 均购自国内和Sigma公司供应商。

1.4 ELISA 诊断

1.4.1 抗原的包被 抗原GST－SAG1t和GST，按5μg/mL剂量加到包被液中（50mmol/L carbonate bicarbonate Buffer，pH值9.6），混匀后加到96孔平底微量板（Castor）的孔里，每孔50μL，并且在4℃条件下培养过夜。

1.4.2 封阻 用含有0.05%Tween 20的 PBS（100mL 10×PBS＋900mL蒸馏水＋0.5mL Tween 20）冲洗1次后，残留的粘附物的部位用含3%脱脂乳的封阻液（3g脱脂乳粉＋90mL蒸馏水＋10mL 10×PBS）进行封阻，每孔100μL，并在37℃条件下培养1h。1.4.3 加样 随后微量板用冲洗液冲洗6次，在封阻液中按1∶100滴度稀释被检血清后，每个样品平行加到微量板的两个孔中，每孔50μL，并在37℃条件下培养1h。

1.4.3 加二抗 用冲洗液冲洗6次后，针对不同来源的血清样品，在封阻液中按1∶4 000滴度稀释辣根过氧化物酶结合了人、羊、犬、马的IgG抗体兔抗人、羊、犬，山羊抗马的二抗，以及Protein A，稀释后每孔加50μL，并在37℃条件下培养1h。

1.4.4 底物 用冲洗液冲洗6次后，每孔加100 μL底物（每毫升底物中含有0.3μg ABTS，0.1 mol/L的柠檬酸缓冲液pH 值4.0和0.003%H2O2），在室温阴暗处放置1h后读数。

1.4.5 读数 用 Wellscan MK 3酶标读数仪 （Labsystems Dragon，Finland）在光吸收值OD415nm条件下测定光吸收值（OD）。

1.4.6 判定标准 ELISA滴度表示成最大稀释度的倒数，且展示ELISA值是等于或大于0.1，在抗原GST－SAG1t孔和GST孔之间的光密度吸收值是不同的，两个孔之间的差值为该被检样品的OD值。两孔阳性血清对照孔的平均值必须大于0.1；两孔阴性血清对照孔的平均值必须低于0.1；两孔待检样品的平均值等于或大于0.1为阳性，低于0.1为阴性。

2 检测结果

利用基于重组的弓形虫表面蛋白1（rSAG1）的ELISA诊断试剂盒，对1090份来自青海省的部分孕妇、藏系绵羊、马、藏獒、骆驼、喜马拉雅旱獭、高原鼠兔、中华鼢鼠、藏羚羊和实验小鼠的血清样品，进行弓形虫特异性抗体的检测，检出56份阳性血清，平均阳性率为5.14%，具体数据见表1。

表1 青海省部分人和动物弓形虫病的血清学调查

3 小结与讨论

3.1 通过调查，发现在所调查的部分孕妇、藏系绵羊、马、藏獒、骆驼、喜马拉雅旱獭、高原鼠兔、中华鼢鼠、藏羚羊和实验小鼠的血清样品，除了在骆驼、藏羚羊和实验小鼠中未检出阳性血清外，其他样品中均检出了，并且在部分孕妇血清中有较高的感染率（7.84%），这个结果与于恩庶报道的5%～10%的感染率基本接近［4］。

3.2 我们已经用所构建的ELISA诊断试剂盒，已经对牛［5］、羊［6］、犬［7］等动物进行了检测，而在本次试验中又对马、骆驼、喜马拉雅旱獭、高原鼠兔、中华鼢鼠、藏羚羊和实验小鼠进行了检测，在检测中对除了人、马、牛、羊、犬和实验小鼠使用相对应的结合了辣根过氧化物酶的二抗外，其他动物均应用了Protein A作为第二抗体。

3.3 部分学者已经对青海省所属区域内的人畜进行过弓形虫感染率的调查，但是同时对一定范围内的人群、家养动物、部分野生动物和实验动物中弓形虫的血清流行病学没有进行过调查，为此本试验的旨意在于通过本次调查，探究我省人群、家畜和野生动物之间弓形虫的感染情况，为今后控制该病提供一定的流行现状基础数据。

［1］ Montoya J，Liesenfeld O.“Toxoplasmosis”［S］.Lancet，2004，363（9425）：1965－1976.

［2］ ones J L，Kruszon－Moran D，Sanders－Lewis K，etal.“Toxoplasma gondii infection in the United States，1999－2004，decline from the prior decade”［J］.Am J Trop Med Hyg，2007，77（3）：405－410.

［3］ 管刚，牛小迎，马利青.猪弓形虫病的ELISA诊断及试剂盒的建立［J］.中国兽医杂志，2008，44（6）：83－84.

［4］ 于恩庶，中国弓形虫病［M］.香港：香港亚洲医药出版社，2000：159－171.

［5］ 陆艳，马利青.青海省牛弓形虫病的ELISA诊断及试剂盒建立［J］.中国动物检疫，2009，26（10）：40－41.

［6］ 蔡其刚，马利青.青海省绵羊弓形虫病的ELISA诊断方法的建立及血清学调查［J］.中国兽医杂志，2010，46（3）：39－40.

［7］ 牛小迎，陆艳，马利青.青海省西宁地区弓形虫病的血清学调查［J］.中国动物检疫，2009，26（07）：43.