王 璞，盛巧玲，李 鑫，孟祥莉，张文龙，王君伟

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030）

A型产气荚膜梭菌（C.perfringenstypeA）可以感染包括牛在内的多种动物，导致肠毒血症、坏死性肠炎、创伤性气性坏疽、猝死症等，其特点为发病急、病程短、致死率高，给养殖业造成巨大经济损失［1］。因此，产气荚膜梭菌病发病机制及防治技术的研究亟待深入。一种良好的动物模型是研究疫病发病机制及防治技术的必备条件之一，国内外均有利用小鼠建立产气荚膜梭菌感染动物模型的报道［2］。然而国内相关研究更多关注小鼠的死亡率，而对其组织病理变化报道很少［3］，本试验以牛源A型产气荚膜梭菌C987株为基础，摸索不同细菌接种途径，建立了产气荚膜梭菌小鼠感染模型，并对小鼠器官病变及组织学变化进行观察，为A型产气荚膜梭菌病防治技术开发及致病机制研究提供了一种合适的动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料 A型产气荚膜梭菌强毒株C987株，购自中国兽医药品监察所；清洁级昆明系小鼠，购自哈尔滨市肿瘤医院；无菌绵羊血，购自赛拓科技有限公司；日本三菱瓦斯厌氧产气袋，购自北京陆桥生物技术有限责任公司；肉肝汤培养基，购自上海江莱科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌形态学鉴定 A型产气荚膜梭菌强毒株C987株划线于5%绵羊血平板上，37℃厌氧培养14h。观察菌落形态，挑取单个菌落接种于10mL肉肝胃酶消化汤中，培养基上方加入1mL灭菌石蜡，静置培养24h。涂片革兰染色，观察菌体形态。

1.2.2 细菌生长曲线的绘制 挑取单菌落，接种于10mL肉肝胃酶消化汤中，静置培养10h。培养物按5%接种到120mL肉肝胃酶消化汤中，每2小时测定菌液OD600值，连续监测24h。前6h取100μL菌液进行10－4倍稀释，6h后取100μL菌液进行10－6倍稀释，稀释后菌液取100μL涂布于5%绵羊血平板上，每个稀释度涂布3个平板。平板于37℃厌氧培养14h，进行菌落计数，绘制细菌生长曲线。

1.2.3 动物试验 15～20g昆明系小鼠55只，随机分为11组，每组5只。第1～6组用灌胃方式接种（灌胃前禁食1d，饮水正常），第7～11组用背部皮下多点注射方式接种。第1组灌胃肉肝胃酶消化汤1mL，作为灌胃接种试验阴性对照，第2～6组分别灌胃接种产气荚膜梭菌浓度5.5×108CFU/mL、1.1×109CFU/mL、2.2×109CFU/mL、4.4×109CFU/mL、8.8×109CFU/mL菌液1mL。第7组背部皮下多点注射肉肝胃酶消化汤1mL，作为皮下注射接种试验阴性对照，第8～11组分别注射接种产气荚膜梭菌浓度3×106CFU/mL、6×106CFU/mL、1.2×107CFU/mL、2.4×107CFU/mL菌液1 mL。每6小时观察1次，连续观察240h，记录小鼠精神状态、毛色、进食、进水情况、死亡数量及死亡时间。利用SPSS18.0软件绘制小鼠生存曲线图，用LD50数据处理程序1.01版本计算不同接种途径，A型产气荚膜梭菌对小鼠半数致死量（LD50）。

1.2.4 小鼠病理变化观察 240h内死亡小鼠剖检，观察心、肝、脾、肺、肾等脏器病变情况并涂片镜检，每组随机选取1只，采集其内脏器官做石蜡切片，并进行组织化学染色观察。240h后将未死亡小鼠断颈处死，取心、肝、脾、肺、肾等脏器涂片镜检。

2 结果

2.1 A型产气荚膜梭菌C987株生长曲线的绘制C987株在6h达到对数生长期末期，此时OD600＝1.67，菌液浓度为5.5×108CFU/mL（见图1）。

图1 产气荚膜梭菌生长曲线

2.2 动物试验 小鼠接种产气荚膜梭菌后，出现后肢麻木、精神极度委靡、皮毛凌乱、腹部膨大等症状，各组小鼠出现的症状及开始出现症状的时间（见表1）。第5、6、10、11组小鼠腹部膨大明显，第2、3、8组小鼠腹部膨大不明显。剖检涂片显示，第4、5、6、9、10、11组死亡小鼠心、肝、脾、肺、肾、肠有革兰阳性大杆菌检出；第2、3组死亡小鼠除肠道外，其他器官无细菌检出。对照组小鼠无病理变化。

经计算，A型产气荚膜梭菌C987株灌胃途径接种小鼠LD50为4.35×109CFU，背部皮下多点注射途径接种小鼠LD50为8.01×106CFU。

2.3 小鼠组织病理观察结果 死亡小鼠的肠道臌气明显并伴有出血，肝脏肿大、充血，表面不光滑，脾脏肿大、充血。

通过组织化学检查表明，与对照组小鼠相比，试验组小鼠的肝脏中央静脉充血、出血，肝细胞索状排列结构消失，组织间隙有大量炎性细胞浸润，明显可见胞内出现核碎裂、溶解，肝脏细胞发生颗粒变性，同时可见肝细胞溶解；小肠上皮细胞脱落、坏死，肠绒毛结构消失，组织间隙内出现大量炎性细胞，同时可见明显出血；肺泡上皮细胞增生，同时伴有变性和坏死，肺泡内可见纤维样渗出，肺泡组织间隙可见出血，同时有大量炎性细胞渗出；脾脏出血明显；肾小球肿胀、淤血，肾小囊腔间隙变小，肾小管上皮细胞发生肿胀、变性、坏死，肾小管管腔变小，肾小管间隙出血明显，同时伴有大量炎性细胞浸润；心肌纤维碎裂，细胞核溶解，心肌纤维毛细血管淤血明显，细胞间质有出血，同时可见大量炎性细胞浸润（见中插彩版图2）。

表1 不同接种菌数小鼠出现临床症状时间以及死亡数量

3 讨论

使用动物模型是现代兽医科学研究中极为重要的试验方法和手段，有助于更方便、更有效地认识疾病的发生、发展规律和研究防治措施。一种良好的动物感染模型能够增加试验结果的准确性，简化试验操作并且能够较为完善地反映本动物自然发病过程中的大部分病理特征。

本试验尝试采用灌胃和皮下注射两种接种方式建立产气荚膜梭菌小鼠感染模型。从产生的症状及病变情况来看，两种接种方式差别不大。虽然通过灌胃接种，更接近产气荚膜梭菌肠道感染的天然途径［4］，但皮下注射接种方式所需细菌接种量远少于灌胃接种方式，而小鼠死亡率却高于灌胃接种；另外，皮下注射接种细菌数量相对稳定，小鼠死亡时间更加集中，试验平行性更佳，因此皮下多点注射接种途径更适合用于建立产气荚膜梭菌小鼠感染模型。

相关报道表明，牛感染产气荚膜梭菌后腹部高度膨胀，心外膜及心内膜有不同程度的出血点或出血斑［5］，脾肿胀、被膜下或边缘部有出血点，肠管外观呈暗红色，肠黏膜严重出血［6］，肾脏肿大、被膜出血、实质变软，重者泥状，肝脏肿大质脆、色泽暗淡、有充血斑［5］。本试验中，接种小鼠内脏病理变化及组织学变化与上述报道极为相似，说明建立的A型产气荚膜梭菌小鼠感染模型可以在很大程度上模拟牛感染A型产气荚膜梭菌后内脏的病理变化，因此该模型不仅可以用于各种A型产气荚膜梭菌疫苗的评价，同时可以用于A型产气荚膜梭菌致病机制的研究。

［1］ 德艳艳，姜志刚，牛思博.携带非典型cpb2基因牛源A型产气荚膜梭菌重组α毒素的免疫保护性研究［J］.中国预防兽医学报，2012，23（7）：563－567.

［2］ Kerry K，Cooper J.Glenn Songer.Virulence of Clostridium perfringens in an experimental model of poultry necrotic enteritis［J］.Veterinary Microbiology，2010，142：323－328.

［3］ 石玉玲，徐少珊，孙朝晖，等.小鼠气性坏疽动物模型的建立［J］.热带医学杂志，2011，11（3）：299－303.

［4］ Fernandez－Miyakawa，Sameera Sayeed.Development and Application of an Oral Challenge Mouse Model for Studying Clostridium perfringens Type D Infection［J］.Infection and Immunity，2007，75（9）：4282－4288.

［5］ 郑晓丽，窦贤明，胡道俊，等.产气荚膜梭菌对养牛业的危害及其防制 ［J］.中国畜牧兽医，2010，37（8）：211－214.

［6］ 倪宏波.牛产气荚膜梭菌肠毒血症的诊断［J］.中国兽医杂志，2006，42（6）：53－54.