张金凤，侯振中

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030）

反刍动物的干扰素Tau（IFNT）最初是作为一种抗黄体溶解因子被发现的［1］。后经基因及氨基酸序列分析被归类为Ⅰ类干扰素［2］。研究表明，在胚胎着床前期，反刍动物的胚胎分泌IFNT作用于子宫内膜并抑制黄体溶解素－前列腺素F2α（PGF2α）的释放，进而维持黄体的功能。此外，IFNT可以同其他的干扰素一样诱导多种干扰素刺激基因（IFN－stimulated genes，ISGs）在子宫内膜表达［3］，这些基因与孕酮诱导的基因共同作用于子宫内膜，调节与子宫容受性相关的一系列生理过程，如胚胎与子宫腔表面的接着、胚胎的生长发育、母体免疫系统调节、子宫间质细胞分化、子宫内膜血管发育、营养物质向子宫腔的运输及母胎间的分子交换等，对反刍动物妊娠的成功建立起着决定性的作用［4］。但IFNT基因表达的分子调控机制一直未被完整的建立起来。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物样品 本试验中所用的动物样品为日本黑毛和牛和荷斯坦母牛，由东京大学实验动物中心提供。涉及的所有动物操作都经过东京大学和Zen－noh公司胚胎移植中心的实验动物委员会认可。同期发情、超数排卵及胚胎移植方法见文献［5］。首先对日本黑毛和牛进行超数排卵及人工授精，收集妊娠第7天的胚胎（Day0＝发情当天）。将收集到的胚胎通过非外科手段移植至处于发情期第7天的荷斯坦母牛的子宫角内。将处于生长期的妊娠第17、20、22天胚胎通过非外科的子宫冲洗方式获得。子宫冲洗后胚胎，1 000r/min离心5min，速冻保存，并送实验室待检。

1.1.2 细胞样品 人绒毛膜癌JEG3细胞（HTB36，American Type Culture Collection，ATCC，Rockville，MD），用于本试验中的质粒转染及荧光素酶分析。培养液组成：DMEM（Invitrogen，Carlsbad，California）；10%v/v胎牛血清（JRH Bi－osciences，Lenexa，KS）；抗生素/抗霉菌素溶液（Invitrogen公司）。培养条件：37℃，5%CO2细胞培养箱（SANYO公司，型号：MCO－19AIC）。

1.1.3 用于PCR的引物 本试验中用到的引物参照GenBank上各全序列确定引物，由Life Technologies Japan Ltd合成，具体引物见表1。

表1 用于PCR的引物

1.1.4 本试验中用于荧光素酶分析的质粒 见表2。

表2 用于荧光素酶活性分析的质粒

1.2 试验方法

1.2.1 PCR分析 将制备好的RNA反转录模板－cDNA 3μL用ExTaq聚合酶试剂盒按照说明书进行PCR分析。反应体系：0.5UExTaq聚合酶，1xExTaqBuffer，0.2μmol/L 上 下 游 引 物，0.2 mmol/L dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸），cDNA 3 μL，最后用分子生物学级超纯用水调整反应体积为20μL。反应条件：（1）95℃反应2min；（2）95℃30 s；（3）57℃30s；（4）72℃30s；（5）72℃10min；（6）4℃ ∞。其中（2）～（4）步重复30循环。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，溴化乙锭显色，在紫外光照射仪下观察并记录结果。

1.2.2 质粒构建 本试验中以pGL 3为质粒载体，IFNT基因5′端上游区域切除或点突变以制备各种长度的IFNT荧光素酶报告基因。牛IFNT荧光素酶报告基因构建及转染方法见文献［6］，具体的荧光素酶报告质粒如图1所示。

图1 IFNT荧光素酶报告基因构成

1.2.3 荧光素酶分析 使用荧光素酶检测试剂盒（Promega），用荧光免疫分析仪（Perkin Elmer，型号：1420），按照厂家说明书进行操作。

1.3 统计学分析 所有的定量数据以均数±标准差（±SD）表示，使用SPSS 16.0统计软件进行显著性分析，P＜0.05为差异显著；并通过Excel 2007进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 牛着床前期胚胎中TEAD家族基因表达情况如图2所示。

图2 牛着床前胚胎中IFNT基因及TEAD家族基因的表达情况

本试验中，取牛着床前胚胎（妊娠第20天），通过PCR方法检测TEAD家族基因表达情况。由图2可以看出，牛着床前胚胎中，TEAD家族各成员都有表达，但是TEAD2的表达量极少。

2.2 牛各器官中TEAD家族基因表达 本试验中，取牛各器官组织，通过PCR方法检测TEAD家族基因表达情况。表达结果如图3所示。

由图3可以看出，TEAD2在各器官表达量极少，甚至不在肝脏和皮肤组织中表达；其余TEAD家族各成员在各种器官（如心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、皮肤、乳腺、胎盘）中都有表达，但是TEAD1的表达量相对较少。

2.3 牛胚胎及各器官中YAP1基因的表达 牛胚胎及各器官中YAP1基因表达情况如图4所示。

图3 牛各器官中TEAD家族各成员的表达情况

本试验中，取牛着床前胚胎（妊娠第20天）及各器官组织，通过PCR方法检测YAP19基因表达情况。由图4可以看出，YAP1基因可表达于牛着床前胚胎及各器官中。

2.4 荧光素酶分析法检测TEAD家族和YAP1对IFNT基因表达的调节

2.4.1TEAD1和YAP1对IFNT基因表达的调节如图5所示。

将TEAD1和YAP1质粒与IFNT5′端切除报告基因共转染入JEG3细胞中，用荧光素酶分析法分析TEAD1和YAP1对IFNT基因的表达调控及其可能的作用位点。

由试验结果可以看出，在IFNT基因5′端上游区域逐渐切除的情况下，YAP1对IFNT基因的表达都有显著的上调作用；TEAD1对IFNT基因表达的影响不显著，但在将IFNT基因5′端上游区域切除到150bp时，TEAD1可使IFNT基因表达显著升高；TEAD1和YAP1共同作用时，协同效果不显著。

2.4.2IFNT基因点突变时TEAD1和YAP1对IFNT基因表达的调节。

在IFNT基因点突变的情况下，TEAD1和YAP1对IFNT基因表达的调节如图6所示。

本试验中，使用5′端上游区域为631bp的IFNT报告基因，同时，该报告基因进行了不同的点突变：AP1结合位点（－593bp）点突变；CDX2结合位点点突变（－300bp和－293bp）；可能的TEAD结合位点点突变（－470bp）。

由试验结果可以看出，在－631bp－IFNT报告基因中，YAP1对IFNT基因的表达都有显著的上调作用，并且这种上调作用不受AP1、CDX2及可能的TEAD结合位点点突变的影响；当TEAD1和YAP1共同作用时，协同效果不显著。

图6 IFNT基因点突变时，TEAD1和YAP1对IFNTc1基因表达的调节

3 小结与讨论

IFNT基因主要由反刍动物着床前胚胎滋养层细胞表达，目前已发现可结合于IFNT基因5′端启动子区域，使IFNT表达上调的转录因子有ETS2［7］，AP1［8］，CDX2［6，9］，GATA2/3［10］，此外，有研究表明，在哺乳动物发育期间，大多数的胚胎和胚外组织至少表达一种TEAD蛋白［11］。TEAD家族蛋白与转录共激活因子YAP（Yes associated protein）结合，参与到Hippo信号通路中，调控细胞接触性抑制，控制器官体积和癌症发生［12］。

本研究探讨了TEAD1和YAP1对牛IFNT基因的表达调控作用。研究发现，TEAD1对IFNT基因的表达影响不显著；YAP1对IFNT基因表达具有显著的上调作用，并且这种上调不受到IFNT基因5′端上游区域切除或已知转录因子结合位点点突变的影响，据此推测YAP1对IFNT基因的上调作用很可能不是通过其启动子区域实现，而是间接实现的。具体研究机制还有待进一步的研究。

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