马 辉，边传周，赵绪永，郑宝亮，郑 鸣

（郑州牧业工程高等专科学校 生物工程系，河南 郑州450011）

鹅副黏病毒病是由鹅副黏病毒（GPMV）引起的急性病毒性传染病，病鹅及其分泌物、排泄物是本病的主要传染源，主要以消化道病变为特征。成年鹅群流行过程中发病率高达50%～70%，死亡率达10%～20%左右；在15日龄以下的鹅群中可引起100%的死亡，给养鹅业带来了很大的经济损失［1］。

1997年，我国王永坤等首次用SPF鸡胚从患病鹅群中分离出鹅副黏病毒，此后陆续分离到多株病毒［2］。鹅副黏病毒（GPMV）属于副黏病毒科，副黏病毒亚科，腮腺炎病毒属，该病毒与新城疫病毒有部分相同的免疫原型［3］。鹅副黏病毒颗粒大小不一，形态不整，表面有密集纤突结构，病毒内部有囊膜包裹着的螺旋对称的核衣壳。基因组为单股负链线型RNA，约15kb，包括6组基因，主要编码6种结构蛋白，其中M蛋白、HN蛋白和F蛋白为外膜蛋白，存在于病毒衣壳外，L蛋白、NP蛋白和P蛋白为内部蛋白，存在于衣壳内；另外，在GPMV基因转录中P基因还可产生V和W两种非结构蛋白［4］。

L基因编码的L蛋白是GMPV所有结构蛋白中分子量最大的一个，含2 204个氨基酸。L蛋白与P蛋白一起构成有活性的病毒转录复合物［5－6］。本试验通过RT－PCR方法扩增了国内分离株SF02的L基因的部分片段，经序列测定验证，构建了GPMV L基因片段的原核表达载体，并进行了诱导表达和表达蛋白抗原性的检测，获得了重组的L基因主要抗原表位区，为进一步研究L蛋白的功能及鹅副黏病毒病的预防和控制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 质粒和受体菌 鹅副黏病毒SF02株由郑州牧业工程高等专科学校中心实验室保存；pGEM－T，购自 TaKaRa公司；pGEX－6P－1、大肠杆菌 DH5α、BL－21由郑州牧业工程高等专科学校生物技术实验室保存。

1.2 主要试剂 dNTP Mixture、限制内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、DNA Ligation Kit Ver.2.0、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、RNA酶抑制剂、DL－2 000DNA Marker和蛋白质分子量标准等，购自TaKaRa公司；高保真酶KOD－Plus，购自TOYOBO公司；TRIzol试剂盒，购自Invitrogen公司；M－MLV反转录酶，购自Promega公司；Glutathione Sepharose 4B亲和层析树脂，购自Pharmacia Biotech公司；兔抗鸡IgG辣根过氧化物酶标记抗体，购自Sigma公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，鸡抗GPM V血清由本实验室制备。

1.3 扩增GPMV2L基因片段的引物的设计 参照GPMV SF02［7］株全基因组序列，使用Primer Premier 5.0设计1对引物扩增F基因，引物序列为：

上 游 引 物P1：5′－GAAGGATCCATGGCGGGCTCCGGTCCTGAA－3′（BamHⅠ），下游引物P2：5′－CCGCTCGAGGTTCAGGTTTCCGTAGACTAA－3′（XhoⅠ）。

1.4 鹅副黏病毒的增殖与RNA的提取 种毒经1∶5 000稀释后，接种于10日龄SPF鸡胚绒毛尿囊腔（0.2mL/胚），同时以无菌生理盐水相同条件接种作为对照，37℃培养，收集24～48h接种病毒的死亡鸡胚尿囊液及对照组尿囊液，保存于－70℃备用。用Trizol试剂提取病毒RNA，对照组尿囊液以相同条件及步骤进行处理。

1.5 扩增L基因片段 RT－PCR反应参照 MMLV Reverse Transcriptase RNase H Minus的说明进行，加入设计的引物以合成第一链。以cDNA为模板，高保真酶KOD－Plus扩增了L基因片段，PCR反应体系为：PCR Buffer 5μL，dNTPs 5μL，Mg2＋2μL，P1、P2引物各1.5μL，cDNA 模板2 μL，KOD－Plus（1.0U/μL）1μL，加无菌水至总体积为50μL。PCR扩增程序如下：94℃ 变性5min，然后94℃1min，58℃1min，68℃1min，30个循环，72℃ 延伸10min。以琼脂糖凝胶电泳30min，分析并记录扫描结果。阴性对照用无菌水代替模板。

1.6 重组表达载体的构建及鉴定 将回收的L基因片段与pGEX－6P－1载体经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后通过T4DNA连接酶连接，采用氯化钙转化法，将连接产物转化入BL－21感受态细胞中，涂布于含Amp的LB平板上，37℃培养过夜。经菌落PCR鉴定和质粒的酶切鉴定，将阳性重组质粒送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。

1.7 重组菌的诱导表达 取重组菌接种至含Amp的LB液体培养基中，培养至OD600为0.6时，加入IPTG以不同的终浓度50μmol/L、100μmol/L，不同的诱导时间2h、3h、4h，不同诱导温度30℃、37℃进行诱导，以 pGEX－6P－1－L不加IPTG 为对照。菌体经超声波破碎，制备蛋白质电泳样品，使用SDS－PAGE方法检测融合蛋白表达情况。

1.8 GST－L融合蛋白的亲和纯化 将Glutathione Sepharose 4B树脂填料与菌体超声破碎后的上清混匀，室温孵育，填料亲和吸附融合蛋白后弃去上清；然后加1倍柱床体积的还原性谷胱甘肽洗脱，使融合蛋白从填料中释放。SDS－PAGE检测每次的洗脱产物，并利用Bradford法测定纯化蛋白含量［8］。

1.9 Western blot检测重组蛋白的抗原性 将GST－L融合蛋白进行 Western－blot检测，以鹅副黏病毒阳性鸡血清作为一抗，用兔抗鸡IgG辣根过氧化物酶标记抗体作为二抗［9］。

2 结果与分析

2.1 GPMV L基因片段的克隆 以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测到561bp左右的片段，与预期目的大小相符（图1）。

图1 GPMV L基因片段扩增

2.2 原核表达载体pGEX－6P－1－L的鉴定 用BamHⅠ和XhoⅠ对重组质粒双酶切，出现预期大小的片段（图2）。将酶切鉴定后的重组质粒送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序，结果显示，L基因片段与pGEX－6P－1载体连接正确，说明pGEX－6P－1－L表达载体构建成功。

图2 pGEX－6P－1－L双酶切

2.3 重组蛋白的诱导表达和检测 将带有重组表达质粒的BL21重组菌培养后，IPTG终浓度50 μmol/L，37℃培养3h诱导条件下，SDS－PAGE显示在大约47kD处有蛋白表达，与预期大小一致，且在沉淀和上清中都存在，检测上清中融合蛋白含量为380mg/L。大量诱导表达GST－L融合蛋白，使用Glutathione Sepharose 4B树脂填料亲和纯化，得到了较高纯度的融合蛋白（图3）。

图3 pGEX－6P－L诱导表达产物和纯化结果的SDS－PAGE分析

2.4 纯化的重组蛋白的Western blot分析 表达产物经SDS－PAGE后，电转移至硝酸纤维素膜（NC）上，进行 Western blot检测，在47kD左右可见特异性条带（图4），说明pGEX－6P－1－L重组蛋白可与鹅副黏病毒多克隆抗体反应，表明重组蛋白具有较好的抗原性。

图4 重组质粒pGEX－6P－1－L表达产物的 Western blot检测

3 讨论

随着基因工程技术的发展，越来越多的载体在原核、真核系统中可以有效进行蛋白表达。原核表达具有操作方便、快捷、需时较短、表达量大、适合工业化生产等优点，pGEX表达系统中GST融合表达蛋白可以增加外源蛋白的可溶性，并且GST标签利于后续的纯化，另外融合蛋白中的GST标签可以被蛋白酶很方便的切除下来。

目前，鹅副黏病毒具有高度发病率和死亡率，给养鹅业带来了巨大的经济损失。鹅一旦发病，目前并无明显治疗效果的药物。在预防鹅副黏病毒病时主要方法为疫苗免疫，目前使用的弱毒苗存在着毒性返祖的危险，而鹅副黏病毒油乳剂灭活苗免疫时常需同时注射抗鹅副黏病毒血清，且存在免疫期短，免疫时常失败等情况［10］。

L蛋白是鹅副黏病毒转录复合物的主要部分，其中L蛋白N端数个氨基酸参与病毒RNA的转录与修复，而且不同于HN和F蛋白，L蛋白这一区段具有高度保守性，具有良好的免疫原性，因此L蛋白可以用作鉴别副黏病毒的诊断抗原［11－12］；另外鹅副黏病毒病在形态学上与其他禽副黏病毒病难以区分，急需建立特异敏感的免疫学诊断方法，因此我们克隆表达了L基因的N端部分，通过SDS－PAGE电泳和Western－blot的结果表明，表达的蛋白质相对分子质量为47kD，与理论值相符；并通过亲和纯化为制备大量及高纯度的GPMV诊断抗原打下了良好的基础。我们期望通过融合表达鹅副黏病毒抗原区为研制鹅副黏病毒亚单位疫苗和筛选L蛋白特异单抗奠定基础。

［1］ 谢之景，夏咸柱，扈荣良，等.鹅副黏病毒基因型的调查［J］.中国兽医学报，2004，24（5）：421－424.

［2］ 王永坤，田慧芳，周继宏，等.鹅副黏病毒病感染的研究［J］.广西畜牧兽医，1999，15（6）：7－11.

［3］ Olivier Poch，Benjamin M.Blumberg，Lydie Bougueleretet al.Sequence Comparison of Five Polymerases（L proteins）of Unsegmented Negative－strand RNA Viruses：Theoretical Assignment of Functional Domains［J］.J Gen Virol May，1990，71：1153－1162.

［4］ Walter C T，Barr J N.Recent advances in the molecular and cellular biology of bunyaviruses［J］.J Gen Virol，2011，92（Pt 11）：2467－2484.

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［9］ 汪家政，范明.蛋白质技术手册［M］.北京：科学出版社，2000.

［10］刘华雷，王永坤，周继宏，等.鹅副黏病毒毒力特性的研究［J］.中国预防兽医学报，2000，22（3）：164－169.

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［12］Dochow M，Krumm S A，Crowe J E Jr，etal.Independent structural domains in paramyxovirus polymerase protein［J］.J Biol Chem，2012，287（9）：6878－6891.