田 野，苏丹萍，蒋 伟，钟 望，张显浩，陈瑞爱，，贺东生，

（1.华南农业大学兽医学院 广东省人畜共患病重点实验室，广东 广州510642；2.广东大华农动物保健品股份有限公司，广东 新兴527400）

猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于冠状病毒成员，为有囊膜的单股正链RNA病毒，以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病［1］。在1971年比利时和英国，该病毒被首次报道，之后在很多养猪国家都暴发了该病，特别是欧洲和亚洲。我国从1976年开始陆续有PED的报道，20世纪80年代后该病在中国流行面逐渐扩大，并多与猪传染性胃肠炎、轮状病毒等其他肠道病原混合感染，给养猪业造成严重经济损失［3］。

PEDV主要的结构蛋白包括：纤突蛋白（S，180～220kD）、膜蛋白（M，27～32kD）、核衣壳蛋白（N，55～58kD）和小包膜蛋白（E，8.8kD）。其中PEDV的S基因长为4 150bp，由其编码的S蛋白位于病毒粒子表面，在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞和在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中都发挥重要生物学作用［4－5］。PEDV 的主要中和抗原存在于 S 基因的1 495～1 914bp之间［6］。本次试验研究分离鉴定华南地区PEDV流行毒株并对其S基因变异进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 病料、试剂盒载体 2012年2月份，从华南地区某大型猪场采集疑似猪流行性腹泻病料，即小肠和肛拭子。MLV、RRI、dNTPs、rTaq，购自广州瑞真生物技术有限公司；UNIQ－5柱离心式胶回收试剂盒，购自广州助力生物科技有限公司。

1.2 引物的设计与合成 根据本实验室己建立的PEDV检测体系，合成1对针对PEDV M基因的特异性引物，Pm1：5′－TGCTTCAGTATGGCCATTACAAGTACTCTG－3′，Pm2：5′－CCTGTCGGCCCATCACAGAAGTAGT－3′，用于检测PEDV。根据GenBank上登录的CV777序列设计了1对针对S基因抗原表位（1 495～1 914bp）的引物，Ps1：5′－GAACTCCATTAGCGTATT－3′，Ps2：5′－CTGCAGATGTACAGACATCTA－3′，来扩增目的片段。以上引物是采用PrimerSelect 5.0软件设计，由Invitrogen上海生物技术有限公司合成。

1.3 组织病料PEDV的RT－PCR检测 将研磨好的组织悬液放入1.5mL离心管中，反复冻融3次，5 000r/min离心3min。用Trizol法抽提组织总RNA。根据MLV的说明，取1μL RNA进行反转录，之后产生的cDNA进行PCR检测。

1.4 病毒分离 将阳性病料上清液反复冻融3次，接种到Vero细胞，37℃吸附90min。弃掉毒液后加入含终浓度45μg/mL胰蛋白酶的DMEM（不含血清），培养96h，收毒。用同样的方法，已传到第20代。

1.5 PEDV S基因抗原表位序列的克隆与测序以病毒培养液的RNA为模板进行RT－PCR扩增。用UNIQ－5柱进行PCR产物割胶回收，纯化的PCR产物与pMD18－T载体连接，转化至E.coliDH5α感受态细胞。重组质粒经PCR和酶切鉴定后，由北京奥科鼎盛生物科技有限公司对阳性质粒核苷酸进行测序。

1.6 序列分析 利用Clustalx软件将测序结果与国内外其他地区的PEDV毒株的相同位置进行多重比对，并用软件 Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA，version 4.0）进行遗传进化分析。同时用DNAStar中的MegAlign分析S基因抗原位点氨基酸变化。

2 结果与分析

2.1 PEDV S抗原表位基因克隆、序列测定 应用引物Ps1/Ps2，克隆PEDV S主要抗原表位基因，测序。通过软件分析该段基因与国内外其他毒株的核苷酸同源性，发现华南地区其他毒株如CH/GD－01/2011、GDHSY/2011、CH/GXQZ/2011等位于同一亚群，而与CV777、Chinju99、SM98、Br1/87等毒株的同源性较低（如图2），处于不同的亚群。

2.2 病毒分离 病毒在接种Vero细胞前，先与含终浓度55μg/mL胰蛋白酶的DMEM作用5～10 min，然后接种到Vero细胞上，加入含终浓度45 μg/mL胰蛋白酶的DMEM维持液，96h后收取病毒液。在前5代细胞病变不明显，随着代数的增多细胞病变逐渐典型。连续传代至第20代，且传代后PCR可以检测到病毒（如图1）。在15代左右很明显的观察到合胞体样的细胞病变，而且出现细胞病变的时间也从96h减少到72h。

图1 病毒传代后PCR检测图

2.3 PEDV S抗原表位基因序列的进化分析 利用GenBank上登录的世界各地不同分支的PEDV 55株作为参考，分析S基因抗原位点碱基的变化。其中发现16个碱基的变化（1509C→T，1545G→T，1575C→T，1642A→G，1677T→G，1688G→A，1695T→C，1710C→T，1761A→T，1777G→A，1782T→C，1815C→T，1833T→C，1845T→C，1894C→G，1902C→T）。

2.4 PEDV S抗原表位氨基酸的变化分析 利用DNAStar中的MegAlign对比华南地区毒株CH/GDGZ/2012 与 CV777、Chinju99、Br1/87、DR13、SM98氨基酸序列的同源性分别为97.7%、91.5%、95.4%、98.0%、94.8%。具体变化为：502aa L→S，516aa S→A，548aa T→S，593aa G→S，632aa Q→E（是分别由1 509bp C→T，1 545bpG→T，1 642bp A→G，1 777bp G→A、1 782bp T→C，1 894bp C→G）。这些说明华南地区的PEDV朝着不同的方向变异，有其地缘性。

图2 CH/GDGZ/2012的遗传进化树

3 讨论

Kim S J和 Kwon H M［8－9］等指出和 PEDV 同为冠状病毒TGEV只有1个血清型，然而对比其部分S基因发现不同国家地区存在多样性。同样的PEDV也只有1个血清型，但学者对比分析M和N基因，发现不同国家的PEDV呈现多样性，即使同一地区PEDV也存在不同［10－11］。相对于M、N 基因，S基因是PEDV高变基因，同时也是主要的抗原基因，利用S基因对比序列分析更能反映该病毒的变异性。此次试验通过对比S基因主要抗原位点（1 495～1 914bp），分析华南地区与经典毒株的差异性。

华南地区分离到的CH/GDGZ/2012和CH/GD－01/2011、GDHSY/2011、CH/GXQZ/2011等毒株则位于G1.1.1，与经典疫苗毒株处于不同的分支，遗传距离较远，且其S基因主要抗原表位已经发生较大变异，可能导致经典疫苗产生的抗体不能对感染仔猪产生完全的保护，也与猪场病毒性腹泻疫苗防疫效果不佳的现状相符，可能是2010年冬季至今猪病毒性腹泻大暴发的重要原因。值得注意的是，华南地区的PEDV毒株与泰国2008年、2011年分离毒的亲缘关系很近，该病毒在两国间及国内如何传播值得进一步研究。

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