胡博然，周妍，朱勇，闻雯，张奉民

1(扬州大学 食品科学与工程学院，江苏 扬州，225127)2(扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州，225009)3(扬州大学测试中心，江苏 扬州，225009)

葡萄酒是以鲜葡萄或葡萄汁为原料，经全部或部分发酵酿制而成的，含有一定酒精度的发酵酒［1］，具有天然的保健作用［2］。目前葡萄酒的质量优劣依靠国家标准中规定的酒精度、干浸出物、总酸(滴定酸)、残糖、SO2、挥发酸等有限的几个理化指标来评价［3］。而这些指标只能反映葡萄酒的健康状况，并不能充分反映葡萄酒真正的品质。因此，建立一种能有效鉴别、分析葡萄酒并能探索葡萄酒内在成分差异的方法具有重要的意义。

目前1H NMR与模式识别结合的方法已经应用于研究葡萄酒以及一些液态食品，如油、果汁、绿茶和啤酒等［4－5］。国外有很多实验证明了此方法科学可靠，例如 Hong-Seok Son 等［6－7］利用1H NMR 结合模式识别分析描述不同产区单品种葡萄和葡萄酒代谢产物的特征以及不同年份葡萄酒代谢产物的差异;Licia Viggiani等［8］利用此方法辨别意大利典型DOC葡萄酒的真实性。电子舌技术在食品领域的应用也越来越广泛，李华［9］等利用电子舌技术对昌黎原产区的干红葡萄酒进行检测，结果表明电子舌技术对昌黎原产区的不同品种、不同年份的干红葡萄酒具有明显的区分效果。俄罗斯Legin等［10－11］利用电子舌技术检测不同品种的葡萄酒和矿泉水，结果电子舌技术能区分所有的样品。目前利用NMR技术结合电子舌技术对我国原产区葡萄酒代谢产物的研究还处于空白，因此将其应用到我国葡萄酒品质分析中具有良好的应用前景。

本实验利用NMR技术和电子舌技术来判别分析2个不同产区干红葡萄酒代谢产物的差异，同时优化NMR检测中样品的预处理方法并结合模式识别分析，得到2个不同产区干红葡萄酒的差异并找出对其差异贡献较大的代谢产物，探索出鉴别不同产区干红葡萄酒的有效方法。

1 材料与方法

试验于2012年在国家计量认证中心扬州大学测试中心核磁实验室以及扬州大学食品科学与工程学院电子舌实验室进行。

1.1 实验材料

1.1.1 样品

梅鹿辄(Merlot):2010年份;赤霞珠(Cabernet Sauvignon):2010年份。

沙城产区的梅鹿辄、赤霞珠干红葡萄酒由长城桑干酒庄提供，宁夏贺兰山东麓产区的梅鹿辄、赤霞珠干红葡萄酒由广夏(银川)贺兰山葡萄酿酒有限公司提供。单品种干红葡萄酒均采用标准酿造工艺，酿造过程中均加入相同的酿酒酵母(Lalvin CY 3079)进行发酵，产品质量理化指标均符合国家标准 GB/T 15037－2006。

1.1.2 试剂

重水(氘代度 ＞99.9%)、DSS(4，4-二甲基-4-硅代戊磺酸钠)。

1.1.2 主要仪器

SNL315SV-230冷冻干燥机(美国Thermo公司);AVANCE 600核磁共振波谱仪(德国布鲁克公司);TG16A-WS台式高速离心机(卢湘仪离心机仪器有限公司);电子舌(上海昂申智能科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 核磁样品预处理

将沙城产区的梅鹿辄干红葡萄酒按下面2种不同的方法进行预处理，以期探讨合适的预处理方法。

(1)取各单品种干红葡萄酒在－4℃下，于13 000 r/min 离心10 min，取450 μL 上清液，加入50 μL DSS重水溶液用于定标，装入5 mm核磁管中，进行NMR检测。

(2)取各单品种干红葡萄酒于3 000 r/min离心10 min，分别取上清液3 mL放入冻干瓶中，－70℃冷冻过夜，然后冷冻干燥，冻干的样品中加入540 μL D2O，60 μL DSS重水溶液用于定标，13 000 r/min 离心10 min，取上清液 500 μL，装入 5 mm 核磁管中，进行NMR检测。

1.2.2 NMR图谱测定

葡萄酒一维NMR谱图的实验条件为:温度298 K，采用1H{13C/15N}探头，1H共振频率 600.13 MHz，1C共振频率谱宽7 183.9 Hz，采样点数32 K，采样时间2.3 s，混和时间100 ms，谱线加宽因子为0.3 Hz。先不压制水峰，按照常规实验采样8次，然后采用Noesygppr1d脉冲序列压制水峰，采样次数256次。

1.2.3 NMR数据预处理

利用600 MHz谱仪上的AMIX软件将谱图按0.005 ppm进行分段积分，将4.96～4.8 ppm的残余水峰，1.22～1.18 ppm和3.72～3.57 ppm的残余乙醇峰，0～0.5 ppm、1.84～1.74 ppm 和 2.95～2.90 ppm的DSS峰的数据去除，不进行积分。数据归一化处理后，代入SIMCA－P 12.0软件用于模式识别分析。

1.2.4 电子舌的检测方法

对每个酒样进行检测时，均未对样品进行任何前处理。随机选择酒样，摇晃均匀，开瓶倒取20 ml于电子舌专用样品杯中，在常温下进行检测，每个酒样重复检测3次，不同样品间采用3.5 mol/L的KCl溶液对电极进行清洗。

1.3 数据分析方法

将核磁数据导入SIMCA-P 12.0软件进行模式识别分析，采用最常用的多元统计方法PCA和PLS-DA进行分析。对样品进行分类，同时找出对分类有贡献的生物标志物［12－13］。

PCA模型可以得到得分图，从而获得样品分类的信息。模型的验证主要参考R2、Q2等参数。R2是所解释的模型差异，Q2是所预测的模型差异。理论上说R2、Q2数值越接近1说明建立的模型越好［14］。

PLS-DA只需要一个数据集X，但在分析时必须对样品进行指定并分组，这样分组后模型自动加上另外一个隐含的数据集Y，其他原理与PCA相同。这种模型计算的方法有利于发现组间的异同点，也可以对未知的样本进行预测［14］。

利用电子舌仪器上的主成分分析软件对电子舌检测的数据进行主成分分析。

1.4 计算公式

代谢产物的含量可以通过一维1H-NMR谱中待测物质某一指定基团上质子引起的峰面积与加入的内标物DSS指定基团上的质子产生的峰面积之比换算得到，代谢产物的质量浓度u(g/L)的计算公式如下所示:

其中:AS为被测样品选定信号的积分面积;nS为样品被积分信号包含的质子数;MS为被测样品的相对分子质量;AR为内标DSS选定信号的积分面积;nR为内标DSS被积分信号包含的质子数;MR为内标DSS的相对分子质量;mR为内标DSS的质量。

2 结果与分析

2.1 NMR技术分析

2.1.1 不同预处理条件下干红葡萄酒1H NMR谱图的比较

由于葡萄酒中水分和乙醇含量相对较高，在1H NMR谱图中共振信号较强，从而会对低含量物质的信号产生掩蔽效果。冻干预处理可以减少葡萄酒中水和乙醇的含量，所以本实验探讨了冻干与不冻干的预处理方法，来寻求合适的预处理方法。图1和图2分别为未冻干与冻干预处理的梅鹿辄干红葡萄酒的谱图，通过图1与图2的对比，可以看出图1中主要的信号是乙醇和水，微量物质的信号相对比较微弱，而图2中乙醇和水的信号明显减弱，微量物质的峰信号如甘油、脯氨酸、琥珀酸、2，3-丁二醇等清晰可辨。由此可见冻干不仅可以抑制水和乙醇的信号，对样品也起到浓缩的作用，使谱图中含量比较低的组分得以辨识。

图1 未进行冻干处理的梅鹿辄干红葡萄酒1H NMR谱图Fig.1 1H NMR spectrum of the unlyophilized Merlot dry red wine

图2 进行冻干处理的梅鹿辄干红葡萄酒1H NMR谱图Fig.2 1H NMR spectrum of the lyophilized Merlot dry red wine

2.1.2 不同产区干红葡萄酒的模式识别分析

通过NMR方法得到的谱图信息很复杂，采用常规统计分析方法难以发现样品之间或各组之间的异同。如今在化学计量学方法中，解决复杂体系中归类问题以及标记物搜索的主要手段是模式识别分析。目前，NMR指纹谱与模式识别相结合已经广泛应用于许多领域［15－16］。

将干红葡萄酒样品的核磁检测数据导入SIMCAP 12.0软件中进行主成分分析。经冻干处理后不同产区2010年份的梅鹿辄、赤霞珠干红葡萄酒建立PCA得分图如图3所示，累积贡献率R2X=0.853，Q2=0.728，主成分1(PC1)占总变量的45.9%，主成分2(PC2)占16.4%。通过PC1方向可以看出干红葡萄酒在河北沙城、宁夏贺兰山东麓这2个产区间的分离比较清晰，说明不同产区干红葡萄酒的代谢产物存在显著的差异性，但河北沙城产区的梅鹿辄与赤霞珠干红葡萄酒之间区分不明显。

图3 不同产区的干红葡萄酒1H NMR谱的PCA得分图Fig.3 PCA scores plot derived from the 1H NMR spectra of the lyophilized dry red wines(Merlot and Cabernet Sauvignon)from different regions

在PCA基础上，将干红葡萄酒进行分类后，进行PLS-DA分析，图4是经冻干处理后不同产区2010年份的梅鹿辄、赤霞珠干红葡萄酒建立的PLS-DA得分图，累积贡献率 R2X=0.893，R2Y=0.979，Q2=0.91，PC1占45.9%，PC2占14.7%，模型的适应性与可预测性良好，通过PC1方向可以看出2个产区的干红葡萄酒明显区分开来。PLS-DA得分图与PCA得分图相比，PLS-DA得分图中同一产区品种间的区分比较明显，并且同一品种间的离散程度有所减少，为了形象的描述两个产区干红葡萄酒代谢产物的细微差异，最终选择PLS-DA模型进行两两分析。

2.1.3 不同产区干红葡萄酒代谢产物的比较

将不同产区同种干红葡萄酒进行PLS-DA比较，通过载荷图可找到引起产区之间差异的代谢产物。在建模过程中通过正交信号校正(Orthogonal Signal Correction，OSC)过滤掉与分类信息无关的信息［17］。

图4 冻干处理的不同产区的干红葡萄酒1H NMR谱的PLS-DA得分图Fig.4 PLS-DA scores plot derived from the 1H NMR spectra of the lyophilized dry red wines(Merlot and Cabernet Sauvignon)from different regions.

对宁夏贺兰山东麓产区与河北沙城产区2010年份的梅鹿辄干红葡萄酒建立PLS-DA得分图如图5所示，累积贡献率 R2X=0.733，R2Y=0.996，Q2=0.929(PC1/PC2占73.3%)，通过PC1方向可以看出宁夏贺兰山东麓产区与河北沙城产区的梅鹿辄干红葡萄酒之间有明显的区分，表明不同产区2010年份的梅鹿辄干红葡萄酒间代谢产物存在显著的差异性。

图5 冻干处理的不同产区的梅鹿辄干红葡萄酒1H NMR谱的PLS-DA得分图Fig.5 PLS-DA score plot from the1H NMR spectra of the lyophilized Merlot dry red wines from different regions.

对宁夏贺兰山东麓产区与河北沙城产区2010年份的梅鹿辄葡萄酒建立如图6所示的PLS-DA载荷图，载荷图上部区域处于较高峰表示其对应的代谢产物在宁夏贺兰山东麓产区梅鹿辄干红葡萄酒中含量较高，较低则表示其含量低。从载荷图中可以看出，与沙城产区的梅鹿辄干红葡萄酒中代谢产物相比，宁夏贺兰山东麓产区的梅鹿辄干红葡萄酒中甘油、琥珀酸、脯氨酸、缬氨酸、乙酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖含量较高，而2，3-丁二醇、乳酸、α-D-葡糖醛酸、酒石酸、胆碱、乙酸乙酯、没食子酸含量较低。

图6 冻干处理的不同产区的梅鹿辄干红葡萄酒1H NMR谱的PLS-DA载荷图Fig.6 PLS-DA loading plot derived from the1H NMR spectra of the lyophilized Merlot dry red wines from different regions.

宁夏贺兰山东麓产区与河北沙城产区2010年份的赤霞珠葡萄酒建立如图7所示的PLS-DA得分图，累积贡献率 R2X=0.701，R2Y=0.997，Q2=0.98(PC1/PC2占70.1%)，通过PC1方向可以得到宁夏贺兰山东麓产区与河北沙城产区的赤霞珠干红葡萄酒之间有明显的差异，表明不同产区2010年份的赤霞珠干红葡萄酒间代谢产物有明显的差异。

图7 冻干处理的不同产区的赤霞珠干红葡萄酒1H NMR谱的PLS-DA得分图Fig.7 PLS-DA score plot from the1H NMR spectra of the lyophilized Cabernet Sauvignon dry red wines from different regions.

宁夏贺兰山东麓产区与河北沙城产区2010年份的赤霞珠干红葡萄酒建立PLS-DA载荷图如图8所示，载荷图上部区域较高的峰表示其对应的代谢产物在宁夏贺兰山东麓产区赤霞珠干红葡萄酒中含量较高，较低则表示含量低。从载荷图中可以得到，与沙城产区的赤霞珠葡萄酒中代谢产物相比，宁夏贺兰山东麓产区的赤霞珠葡萄酒中甘油、琥珀酸、缬氨酸含量较高，而2，3-丁二醇、乳酸、乙酸乙酯、乙酸、蔗糖、酒石酸、脯氨酸、胆碱、没食子酸含量较低。

图8 冻干处理的不同产区的赤霞珠干红葡萄酒1H NMR谱的PLS-DA载荷图Fig.8 PLS-DA loading plot derived from the1H NMR spectra of the lyophilized Cabernet Sauvignon dry red wines from different regions.

通过对同一品种、不同产区2010年份干红葡萄酒代谢产物的对比，得出与河北沙城产区的梅鹿辄干红葡萄酒相比，宁夏贺兰山东麓产区的梅鹿辄干红葡萄酒中甘油、琥珀酸、脯氨酸、缬氨酸、乙酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖含量较高，乳酸，2，3-丁二醇、胆碱、α-D-葡糖醛酸、乙酸乙酯、酒石酸、没食子酸含量较低;赤霞珠干红葡萄酒中甘油、琥珀酸、缬氨酸含量较高，2，3-丁二醇、脯氨酸、乳酸、乙酸、蔗糖、乙酸乙酯、酒石酸、α-D-葡糖醛酸、胆碱、没食子酸含量较低。

2个不同产区2010年份的梅鹿辄、赤霞珠干红葡萄酒在代谢产物组成成分方面区别不大，导致其差异的是代谢产物的含量。对2个产区2010年份干红葡萄酒中主要代谢产物进行绝对定量分析，代谢产物的含量可以通过一维1H-NMR谱中待测物质某一指定基团上质子引起的峰面积与加入的内标物DSS指定基团上的质子产生的峰面积之比换算得到。图9显示了干红葡萄酒中8种代表性代谢产物含量的差异，其结果与PLS-DA的分析结果一致。

2.2 电子舌技术分析

2.2.1 不同产区干红葡萄酒的PCA分析

电子舌检测的是葡萄酒代谢产物表现出来的整体特征，样品不需要预处理。对葡萄酒样品进行电子舌技术检测后，建立如图9所示的PCA得分图。从图中可以看出检测所用的干红葡萄酒大量的原始信息压缩到了主成分1和主成分2中，占原始信息量的75.1%，并且主要信息集中在主成分1上。结果显示电子舌对不同产区2010年份干红葡萄酒代谢产物之间的差异性有明显的区分效果。

3 讨论

本实验利用NMR技术和电子舌技术结合模式识别分析方法，得到2个不同产区的干红葡萄酒代谢产物之间有显著的差异，同时找出对分类有贡献的代谢产物。

3.1 多元醇

甘油和2，3-丁二醇是葡萄酒重要的呈味成分，含量仅次于乙醇。2，3-丁二醇是酒精发酵的副产物，通常情况下不影响酒精饮料的感官质量，它使葡萄酒略微带有苦味［18－19］。本实验中与沙城产区的梅鹿辄、赤霞珠干红葡萄酒相比，宁夏贺兰山东麓产区的梅鹿辄、赤霞珠干红葡萄酒中2，3-丁二醇含量相对较低。

甘油对葡萄酒的质量有重要的贡献，影响葡萄酒的口感和质地，使葡萄酒具有粘稠感和甜味［18－19］。本实验中宁夏贺兰山东麓产区的赤霞珠、梅鹿辄干红葡萄酒中的甘油含量相对沙城产区的梅鹿辄、赤霞珠干红葡萄酒较高，由于葡萄酒在酿造过程中条件如亚硫酸盐浓度、发酵温度、酵母菌是相同的，因此本实验干红葡萄酒间甘油含量不同是由宁夏贺兰山东麓产区赤霞珠、梅鹿辄葡萄浆果中糖分不同引起的。

3.2 有机酸

酒石酸是葡萄带进葡萄酒中最主要的酸类物质，浆果中的酒石酸含量主要与果实的成熟度有关，酒石酸在葡萄酒的陈酿过程中会以酒石酸氢钾和酒石酸钙的形式沉淀下来，所以通常酒石酸不用来作为葡萄酒特征代谢产物。

琥珀酸是重要的非挥发性有机酸，它是酒精发酵过程中产生的，影响总酸度。但琥珀酸很稳定，在陈酿的过程中不发生变化［20－21］。本实验中宁夏贺兰山东麓产区的梅鹿辄、赤霞珠干红葡萄酒的琥珀酸含量相对较高。

葡萄酒中的乳酸含量相对很高，几乎观察不到苹果酸的存在，说明干红葡萄酒都经过了苹果酸-乳酸发酵，将苹果酸转变成乳酸或其他物质，这也解释了干红葡萄酒中不含有苹果酸的原因。

3.3 氨基酸

葡萄酒中的氨基酸有很多来源。一些是葡萄浆果中固有的，在发酵后期部分或全部被酵母菌代谢，或者是从死酵母中释放出来，还有一些是由酶降解葡萄中的蛋白质产生的。脯氨酸不是酵母菌的营养物质，因此可以用来作为葡萄酒的生物标记物。Jang-Eun Lee等［19］认为，葡萄酒中脯氨酸的含量取决于环境因素和葡萄品种。除了脯氨酸之外，通过PLS-DA分析找出的另一种氨基酸类生物标记物为缬氨酸。葡萄酒中的缬氨酸在发酵时被酵母菌利用，而又随着酵母菌的自溶而再现。

3.4 糖类

葡萄糖与果糖是葡萄中主要的糖类。在葡萄成熟期开始的时候，葡萄中的葡萄糖含量比果糖高，到了采收期两者的含量几乎持平。本实验找出的糖类主要是蔗糖、α-葡萄糖和β-葡萄糖，2个不同产区干红葡萄酒间这3种糖的浓度差异很小，因此糖类不能作为葡萄酒的特征代谢产物。

3.5 胆碱

胆碱是甜菜碱的前体，是一种水溶性的必需营养物质。在本实验中，胆碱是区分不同产区干红葡萄酒的一个标志，与沙城产区的梅鹿辄、赤霞珠干红葡萄酒相比，宁夏贺兰山东麓产区的梅鹿辄、赤霞珠干红葡萄酒中胆碱的含量相对较低。但胆碱含量与葡萄酒产区之间的关系还需要进一步研究。

图9 干红葡萄酒中主要代谢产物含量比较Fig.9 The content comparison of main metabolites in dry red wines.

图10 不同产区干红葡萄酒的PCA得分图Fig.10 PCA scores plot derived from dry red wines made in different regions.

4 结论

本实验以2个产区2010年份的梅鹿辄、赤霞珠干红葡萄酒为样品，基于核磁共振技术，建立一套可行的样品预处理、核磁共振检测和数据分析的干红葡萄酒分析方法;基于电子舌技术，提供了一种简单快速、对样品无损的干红葡萄酒检测方法。

(1)冻干处理可去除样品中大部分的水分和乙醇，样品浓缩后微量物质的信号增强，使获取的1H NMR谱图信息丰富，有利于代谢产物的差异分析，因此对于1H NMR而言，葡萄酒样品进行冻干处理后识别效果更好。

(2)通过模式识别分析能够较好地将不同产区的干红葡萄酒区分开，所建立的模型的准确性和预测性均很高。与河北沙城产区2010年份的干红葡萄酒相比，宁夏贺兰山东麓产区2010年份的梅鹿辄干红葡萄酒中甘油、琥珀酸、脯氨酸、缬氨酸、乙酸含量较高，乳酸、2，3-丁二醇、胆碱、乙酸乙酯、没食子酸含量较低;2010年份的赤霞珠干红葡萄酒中甘油、琥珀酸、缬氨酸含量较高，2，3-丁二醇、脯氨酸、乳酸、乙酸、乙酸乙酯、胆碱、没食子酸含量较低。同时对2个产区的2010年份的干红葡萄酒中主要代谢产物进行绝对定量分析，其结果与PLS-DA的分析结果一致。下一步可对这2个产区不同年份的干红葡萄酒进行检测分析，有利于深入探讨造成这2个产区干红葡萄酒间差异的主要代谢产物，为葡萄酒品质评价以及鉴别提供理论依据。

(3)核磁共振技术对样品进行预处理时，冻干预处理在去除样品中的水与乙醇的同时，也使部分挥发性成分(如酸、酯、高级醇等物质)被去除，样品有所损失。而电子舌技术能够获取葡萄酒液体样本的味觉特征的总体信息，样品不需要进行预处理，具有高灵敏度、可靠性、重复性的特点，为快速分析不同产区干红葡萄酒的品质提供一种便捷的方法。

(4)核磁共振技术和电子舌技术结合模式识别分析方法得到的结论相吻合，两者相互验证，说明不同产区干红葡萄酒间代谢产物存在明显的差异。

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