张喜峰，杨春慧，罗光宏

1(河西学院农业与生物技术学院，甘肃张掖，734000)2(河西学院凯源生物技术开发中心，甘肃省微藻工程技术研究中心，甘肃张掖，734000)

在葡萄酒加工过程中，每年产生约占葡萄加工量20%～30%的籽渣废弃物，其中主要是葡萄皮种子和果梗等［1］。葡萄籽渣含有多酚类化合物［2］、白藜芦醇［3］、花色素［4］、膳食纤维［5］、蛋白质［6］、黄酮［7］等多种功能性成分。黄酮类化合物有明显的抗溃疡、抗菌、抗炎、生物抗氧化性、抗衰老、治疗心脑血管疾病等药用保健功能，是一类具有广泛开发前景的天然抗氧化剂［8］。

赖泉斌［9］利用水提醇沉的方法获得了葡萄籽总黄酮，但需多次提取，操作繁琐，周期较长。双水相萃取技术具有操作条件温和、处理量大，易于连续操作，传质速度快，被广泛应用生物化学领域。但传统的双水相体系有原料成本较高，高聚物回收利用困难等缺点。以无机盐代替高聚物的普通有机物双水相体系以其价廉、低度、体系简单及后续处理容易等优点，适用于极性物质提取和纯化，使双水相萃取的工业化成为可能［10］。

本文采用无水乙醇和硫酸铵双水相体系萃取葡萄酒下脚料中的葡萄籽总黄酮。通过单因素和Box-Behnken的组合试验，考察粗提液质量分数、pH值、NaCl质量分数对葡萄籽总黄酮萃取过程中分配系数及萃取率的影响，以确定双水相体系萃取葡萄籽总黄酮优化条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料:取甘肃滨河食品工业集团葡萄酒下脚料，经挑选、清洗、晒干，得到干净的葡萄籽。

试 剂:NaNo2、Al(NO3)3、NaOH、无 水CH3CH2OH、(NH4)2SO4、NaCl均为分析纯。

1.2 仪器与设备

PL-203电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，XO-SM5O超声波-微波反应系统(南京先欧仪器制造有限公司)，DKB-501数显超级恒温水浴锅(扬州市三发电子有限公司)，DHG-9101.1电热恒温鼓风干燥箱(上海光谱仪器有限公司，FZ102植物试样粉碎机(北京科伟永兴仪器有限公司)，722型分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 葡萄籽粗提液的制备

准确称取10 g已粉碎的葡萄籽粉末，以1∶8(g∶mL)料液比加入体积分数50%乙醇中，在超声波-微波反应系统下，超声10 min，抽滤，收集滤液得葡萄籽总黄酮粗提液，测定粗提液中葡萄籽总黄酮的含量。

1.3.2 双水相萃取方法

称取一定量无水乙醇、(NH4)2SO4、粗提液、蒸馏水于小烧杯中，使双水相体系总质量为10.00 g，充分振荡使成相物质溶解，并调节体系pH，静置10 min，两相达到相分离，葡萄籽总黄酮富集于双水相系统的上相中，测定相比R和葡萄籽总黄酮的含量［11］，并计算其分配系数K及萃取率Y，如下式:

1.3.3 黄酮含量测定

精确称取芦丁对照品1.0 g用体积分数50%乙醇溶解配制成黄酮浓度为1 mg/mL的乙醇溶液。分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于6 个10 mL 容量瓶中，加入0.30 mL质量分数5%NaNO2溶液，静置6 min，加入 0.30 mL10%Al(NO3)3，静置 6 min，再加入4 mL质量分数4%NaOH溶液，静置15 min后，用水定容至刻度。分别用分光光度计于510 nm测定吸光度A，绘制标准曲线方程:A=1.245x－0.002 4，R2=0.999 2。式中x为溶液中黄酮的质量(mg);A为吸光度值。

1.3.4 乙醇-硫酸铵双水相体系的确定

通过改变乙醇质量分数、硫酸铵质量分数确定双水相体系的组成。

1.3.5 影响葡萄籽黄酮萃取的因素

1.3.5.1 单因素实验设计

在确定了双水相体系组成后，研究黄酮粗提液质量分数、pH值、NaCl质量分数对黄酮提取率的影响。

1.3.5.2 Box-Benhnken Design实验设计

根据单因素实验结果，设计黄酮粗提液质量分数、pH、NaCl质量分数三因素三水平17个组合Box-Benhnken Design实验，确定葡萄籽黄酮萃取的最佳工艺条件。

1.3.6 数据分析

单因素部试验和中心组合试验结果的分别采用Excel和Design-Expert 7.0在试验设计的同时按相应方法进行，所有试验均重复3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 无水乙醇质量分数对葡萄籽总黄酮萃取效果的影响

在无水乙醇-(NH4)2SO4双水相体系中，选择19% 、21% 、23% 、25% 、27% 无水乙醇，(NH4)2SO4质量分数22%，粗提液质量分数为20%组成双水相，室温(25℃)条件下，搅拌至两相充分混匀，对上下相溶液进行分析，结果见图1。

由图1可知，在(NH4)2SO4质量分数一定的情况下，随着无水乙醇质量分数的增加，总黄酮提取率和分配系数都增加，当无水乙醇质量分数达到23%时，总黄酮提取率和分配系数都达到最大，此后，随着无水乙醇质量分数的增加，总黄酮提取率和分配系数都显著下降，其主要原因可能是无水乙醇质量增加了双水相体系的分相能力增加，黄酮在乙醇中溶解度比在水中的大，但乙醇质量分数过高时，其他有机物的溶出量也会增加，而抑制了总黄酮的浸出［12］，因此，确定最佳的无水乙醇质量分数为23%。

图1 无水乙醇质量分数对葡萄籽总黄酮分配行为的影响Fig.1 Effect of the ethnol concentration on Partitioning behaviour of grape seed total flavonoid

2.2(NH4)2SO4质量分数对葡萄籽总黄酮萃取效果的影响

分别选取15%、17%、19%、21%、23%(NH4)2SO4，23%无水乙醇质量分数和葡萄籽总黄酮粗提液质量分数为20%分别组成双水相体系，在室温条件下，搅拌至两相充分混匀，对上下相溶液进行分析，结果见图2。

图2(NH4)2SO4质量分数对葡萄籽总黄酮分配行为的影响Fig.2 Effect of ammonium sulfate concentrationon Partitioning behaviour of grape seeds total flavonoid

由图2可知，随着(NH4)2SO4质量分数的增加，分配系数和萃取率先是逐渐上升，当质量分数达到17%时呈下降趋势。可见，(NH4)2SO4质量分数影响双水相体系，可以改变各相中成相物质的组成和相比［13］，从而影响黄酮在上相中的分配，当(NH4)2SO4质量分数过高时，双水相体系有硫酸铵沉淀析出，影响黄酮浸出［12］，导致分配系数和萃取率随(NH4)2SO4质量分数的增加而下降。因此选择(NH4)2SO4的最佳质量分数为17%。

2.3 粗提液质量分数对葡萄籽总黄酮萃取效果的影响

在室温下，23%无水乙醇-17%(NH4)2SO4双水相体系中，分别加入质量分数为10%、12.5%、15%、17.5%、20%、22.5%的黄酮粗提液，在室温条件下，搅拌至两相充分混匀，对上下相溶液进行分析，结果见图3。

图3 粗提液质量分数对葡萄籽总黄酮分配行为的影响Fig.3 Effect of crude extract concentration on partition of grape seeds total flavonoids

粗提液加入量是双水相萃取的一个重要参数，从成本考虑多加入一些。如图3所示，粗提液的质量分数影响上下相的分配，当粗提液质量分数17.5%时萃取率和分配系数最大。因此，确定粗提液质量分数最佳为17.5%。

2.4 pH值对葡萄籽总黄酮萃取效果的影响

将23%无水乙醇-17%(NH4)2SO4和17.5%葡萄籽总黄酮粗提液，在室温(25℃)条件下，用HCl和NaOH调节体系 pH值，在 pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0条件下，搅拌至两相充分混匀，对上下相溶液进行分析。

图4 pH值对葡萄籽总黄酮分配行为的影响Fig.4 Effect of pH value on partition behaviour of grape seeds total flavonoids

如图4所示，pH＜7时，随着pH值增大分配系数和萃取率逐渐增大;pH=7时分配系数和萃取率达最大;当pH＞7时，分配系数和萃取率随pH值的增大而减小。在无水乙醇-(NH4)2SO4双水相体系中，上相电位为正，下相电位为负，当pH值较低时，黄酮的电离平衡受到影响，并吸附H+而携带正电荷，pH值改变了黄酮的电荷性质，黄酮开始向电位为负的下相富集，分配系数下降，但碱性过强时，会破坏黄酮母核，导致黄酮的萃取率降低［13－14］。因此选择pH 7。

2.5 NaCl质量分数对葡萄籽总黄酮萃取效果的影响

以质量分数为23%的无水乙醇和质量分数为17%(NH4)2SO4作为双水相体系，在 pH 7、室温(25℃)条件下，分别加入 0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3.0%NaCl，搅拌至两相充分混匀，对上下相溶液进行分析。

由图5可知，随着NaCl质量分数增加，分配系数变化基本与萃取率的变化同步。无机盐的加入可以改变两相间的电位差和相比，缩短了分相时间，提高了相分离速度，从而增加了黄酮在上相的分配，但盐质量分数增加到一定程度后，萃取相的极性增强，使黄酮的溶解度下降导致出现盐析现象，使分配系数降低［15］。实验结果可知，NaCl添加量为2.5%时，萃取率最高。因此，选择NaCl质量分数选择2.5%左右为宜。

图5 NaCl质量分数对葡萄籽总黄酮分配行为的影响Fig.5 Effects of NaCl concentration on partitioning behaviour of grape seed total flavonoids

2.6 响应面结果分析

根据以上单因素的试验结果，采用响应面方法进一步优化试验条件。据Box-Behnken的组合设计原理，以萃取率为响应值，在无水乙醇-(NH4)2SO4体系基础上，对粗提液质量分数(A)、pH值(B)、NaCl质量分数(C)设计了3因素3水平的17组试验，其中5组中心点重复试验。选取的试验因素和水平见表1，试验方案和结果见表2。

表1 Box-Behnken设计因素水平表Table 1 Factors and levels ofBox-Behnken Design

2.6.1 Box-Benhnken Design试验数据分析

表2 Box-Behnken设计方案与结果Table 2 Arrangement and results of Box-Behnken Design

以葡萄籽总黄酮萃取率Y为响应值，根据表2的试验结果，用Design-Expert7.0软件进行多元回归分析，具体结果见表3。经回归拟合后，试验因子对响应值的影响可用以下回归方程表示:

回归分析见表3。由表3可知，模型P=0.000 3＜0.05，说明模型拟合程度极显著。失拟项 P=0.064 0＞0.05，失拟项不显著，模型决定系数为96.54%，说明回归方程拟合程度较好。该模型中A、B、A2、C2极显著，C、B2显著，其他项系数均不显著，从表3可看出，A、B、C对黄酮萃取率均有一定影响，按照对结果的影响排序:pH(B)＞粗提液质量分数(A)＞NaCl质量分数(C)。

表3 Box-Behnken试验结果的回归分析Table 3 The regression analysis of Box-Behnken experiment results

2.6.2 响应面交互作用分析与优化

利用Design-Expert软件根据回归方程进行响应面分析，绘制等高线图，结果如图6所示，利用Design-Expert软件对黄酮萃取率的二次多项式数学模型进行求导，可获得该模型极值点，对函数进行分析，获得了各个因素的最佳条件组合:pH 7.2、NaCl质量分数1.97%、粗提液质量分数21.3%。此时模型预测极大值为96.437 2%。

图6 各因素交互作用的等高线图Fig.6 Response plots for the pairwise interactive effects

2.6.3 验证试验

在双水相体系组成不变情况下，在优化条件下进行3组试验，黄酮萃取率平均达到98.8%，与模型预测值接近，说明该模型能准确预见实际萃取情况。

3 结论

双水相体系中乙醇、硫酸铵质量分数、pH值、粗提液质量分数、NaCl质量分数对黄酮萃取率和分配系数均有影响。确定双水相体系组成23%无水乙醇-17%(NH4)2SO4;葡萄籽黄酮所需的最佳萃取条件为:粗提液质量分数21.3%、pH 7.2、NaCl质量分数1.97%，萃取率达到98.8%;该法方法简单，易于掌握，采用低毒的无水乙醇，利于环保且节约试剂。

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