葛平珍，刘洋，王丹，丁苗，周才琼

(西南大学食品科学学院暨重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆，400716)

机体胆固醇含量过高是动脉粥样硬化［1］、阿尔茨海默氏病［2］等重要诱因。文献报道以奶制品中分离得到的降胆固醇乳酸菌较为常见，例如，从内蒙古传统发酵乳制品中分离得到的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NDC 75017［3］、从克非尔(由含乳酸菌、醋酸菌、酵母的开菲尔粒发酵而成的含酒精发酵乳饮料)中分离的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Lp09 和 Lp45［4］等。

发酵酸肉作为我国的传统食品，国外未见相应研究报道。国内研究中［5－8］对湖南侗族传统发酵酸肉的微生物区系及乳酸菌进行筛选鉴定，得到了产酸快且符合产业化优势的米酒乳杆菌。郭晓芸等［9］报道了贵州荔波布依族水族自治县传统发酵酸肉中的优势菌群为芽孢杆菌、乳酸菌和酵母。本实验室系列研究显示，新鲜猪肉经自然条件下厌氧发酵成酸肉后，有大量乳酸菌生长，脂肪及胆固醇含量下降［10］，经对发酵酸肉中降胆固醇乳酸菌进行筛选、生理生化和分子生物学鉴定，得到1株高效降胆固醇的消化乳杆菌SR10(基因片段序列1480 bp)。本实验以此消化乳杆菌SR10为研究对象，对其生理特性及降胆固醇机制进行初步研究，为发酵酸肉产品的功能特性和工业化生产提供基础研究数据，为降胆固醇乳酸菌的应用提供原始菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

消化乳杆菌SR10(Lactobacillus alimentarius SR10)，从实验室自制的自然发酵酸肉中分离得到;药敏纸片(青霉素 G 10 μg/片、新霉素 30 μg/片、四环素 30 μg/片、先锋霉素Ⅴ30 μg/片、苯唑青霉素 1 μg/片、先锋霉素Ⅵ30 μg/片、丁胺卡那霉素 30 μg/片、强力霉素 30 μg/片、氨苄青霉素 10 μg/片、头孢呋新 30 μg/片、庆大霉素 10 μg/片、复达欣 30 μg/片、氧哌嗪青霉素100 μg/片，等);磷酸氢二钾，柠檬酸氢二铵，葡萄糖，吐温80，乙酸钠，硫酸镁，硫酸锰，无水乙醇，磷酸，均为分析纯;蛋白胨，牛肉膏，酵母粉，琼脂粉，胆盐，等。

MRS液体培养基:按参考文献［12］配制。MRS固体培养基:MRS液体培养基，琼脂17 g/L。

1.2 仪器与设备

Milli-Q超纯水装置，美国Millipore公司;SW-CJ-1FD洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司;WH-1微型漩涡混合仪，上海沪西分析仪器厂有限公司;JY92－N超声波细胞粉碎机，宁波新芝科器研究所;722可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司;Avanti J-30I座式离心机，Beckman Coulter;等。

1.3 实验方法

1.3.1 实验菌株的活化

用接种环取4℃斜面保藏的消化乳杆菌SR10于5 mL已灭菌的MRS培养液中，37℃条件下静置培养12 h进行活化。活化3次后，得到的菌株可作为后续实验的原始菌株。

1.3.2 消化乳杆菌SR10的生理特性

(1)最适温度测定［12］:实验菌株 SR10按照0.3%(v/v)接种到10 mL培养液中，在温度为15、20、25、30、35、40、45 ℃条件下分别培养 24 h，以未接种的培养液作对照组，在A600条件下测定其OD值。根据菌液浊度变化判断其最适生长温度。

(2)生长曲线和产酸特性［13］:消化乳杆菌SR10按0.3%(v/v)的量接种到10 mL培养液中，试管按时间编号分别0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24(h)。在测定的最适温度和最适pH条件下培养，每隔2 h在A600条件下测定菌液浊度(OD)和pH值。以时间为横坐标、浊度(OD)和pH值为纵坐标做图，得到菌株生长曲线和产酸曲线。

(3)耐酸性［14］:调整实验菌株浊度(OD)在 0.8～1.0范围内，菌株活菌数约为107CFU/mL。按1%(v/v)接种于pH为2.0，2.5，3.0的MRS培养液中，30℃条件下培养，6 h内，每隔2 h采用梯度稀释法测定培养液中乳酸菌活菌数。平行测定3次，求平均值。以横坐标为时间、纵坐标为单位菌落总数的对数值做图，得到乳酸菌耐酸性曲线。

(4)耐胆盐性［15］:调整实验菌株浊度(OD)在0.8～1.0范围内，菌株活菌数约为107CFU/mL。按1%(v/v)分别接种于胆盐添加量为0.1%、0.2%、0.3%的MRS培养液中，30℃条件下培养，8 h内，每隔2 h采用梯度稀释法测定培养液中乳酸菌活菌数。平行测定3次，求平均值。以时间为横坐标、单位菌落总数的对数值为纵坐标做图，得到乳酸菌耐胆盐曲线。

(5)抗药敏性［16］:实验菌株活化后，用无菌生理盐水将菌液稀释到105CFU/mL，按照涂布接种法将1 mL菌液接种于MRS琼脂平板培养基上，接着将3片药敏纸片均匀放置在接种过的平板上。30℃条件下培养48 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径并记录相关数据。

1.3.3 胆固醇降低机制研究［17－18］

(1)消化乳杆菌SR10在含胆固醇的MRS培养基中培养24 h后，分别测定上清液、沉淀洗液中胆固醇含量，培养液中减少的胆固醇量与沉淀中胆固醇量的差值视为菌株同化的胆固醇量。通过以上方法可得到同化作用和沉淀作用消耗的胆固醇量。

加入2 mL菌液及显色液反应20 min后，在560 nm测定吸光度。培养液经离心(12 000×g，10 min，4℃)得到沉淀，将沉淀用磷酸钠缓冲液(pH 7.0)洗涤两遍，同样条件离心，得到的上清液即为沉淀洗液。同化率计算公式:

式中:D为胆固醇总量;S为上清液中胆固醇含量;X为沉淀洗液中胆固醇含量。

沉淀率计算方法:

式中:D为胆固醇总量;X为沉淀洗液中胆固醇含量。

(2)筛选菌株降胆固醇能力与时间关系:以1%接种量将其接种于高胆固醇培养基中，30℃培养12 h后每隔4 h取样测定培养液中上清液及沉淀洗液中的胆固醇含量。

2 结果与分析

2.1 消化乳杆菌SR10最适温度

SR10在不同温度下生长曲线见图1。SR10最适生长温度为30℃，与大部分乳酸菌最适生长温度一致。

图1 SR10在不同温度下的生长情况Fig.1 The growth of SR10 at different temperature

2.2 消化乳杆菌SR10生长曲线及产酸特性曲线

SR10生长曲线和产酸特性曲线见图2。在MRS培养液中，SR10培养6 h左右从生长期进入对数期，培养12 h左右进入稳定期。产酸速率随着菌体生长密度增大而升高，在培养过程中pH值不断降低，特别是菌体从生长期到对数期下降较为明显，进入稳定期后pH略为下降，最低pH约为4.0。

图2 SR10的生长曲线和产酸特性Fig.2 Growth curves and ability of producing acid of SR10

2.3 消化乳杆菌SR10耐酸性及在不同pH下生存情况

SR10耐酸性如图3所示，在不同pH下培养6 h后的生存情况如图4所示。SR10在pH 2.0、2.5、3.0条件下培养6 h，菌落总数有所下降，其存活率分别为38.02%、48.53%、58.47%。表明筛选菌株在高酸性环境中具有较强的存活力。发酵酸肉在发酵过程中产生酸类物质，使乳酸菌的生长环境酸度升高，筛选菌株具有较强的耐酸性，能够发挥菌株降胆固醇的活性。

图3 SR10在不同pH下的存活力Fig.3 Survival of SR10 under different pH

图4 筛选菌株SR10不同pH下培养6h的存活率Fig.4 Survival of the screened strain SR10 under different pH

一般人体胃部pH范围在3.0～5.0之间，小肠pH在4.0～5.5之间，大肠pH大于5.0。通过对筛选菌株耐酸性实验表明，筛选菌株在酸性条件下具有较强的存活率，如果进入肠道消化系统，不影响菌体生存及其降胆固醇活性，因此，该筛选菌株可作为生产低胆固醇食品的发酵剂或作为活菌制剂应用。

2.4 消化乳杆菌SR10耐胆盐情况

SR10耐胆盐性活性如图5。在培养8 h后，SR10在胆盐添加量为0.1%、0.2%的培养液中基本能够正常生长，在0.3%胆盐添加量中培养8h，SR10的存活率为39.73%，其生长受到了明显抑制。

2.5 消化乳杆菌SR10抗药敏性

图5 SR10在不同胆盐下的存活特性Fig.5 Survival of SR10 under different bile salt

将SR10活化后接种到MRS琼脂培养基平板上，贴上不同药敏纸片，培养48 h后观察并用游标卡尺测量不同抗生素药品纸片抑菌圈大小，结果见表1。

表1 SR10对不同抗生素敏感性结果Table 1 sensitivity to different kinds of antibiotics of SR1

消化乳杆菌SR10对氨苄青霉素、美满霉素、麦迪霉素和青霉素G的抑菌圈直径都在35 mm以上，最大为美满霉素达38 mm，抑菌圈直径在35～25 mm之间的是四环素、羧苄青霉素、氯霉素、氧哌嗪青霉素和强力霉素。抑菌圈直径在25 mm以下的是头孢呋新、头孢唑林(先锋V)、头孢氨苄(先锋IV)、头孢拉定(先锋VI)、新霉素、丁胺卡那霉素、苯唑青霉素、复达欣、卡那霉素和庆大霉素。其中卡那霉素抑菌圈直径最小为7.44 mm。综合考虑纸片的抗生素含量与抑菌圈大小，消化乳杆菌SR10对青霉素G和氨苄青霉素的敏感性较强。大部分抗生素对筛选菌株SR10的生长都有不同程度的影响。所以在酸肉发酵过程中注意避免抗生素对肉制品中乳酸菌的干扰。

2.6 消化乳杆菌SR10降胆固醇作用

消化乳杆菌SR10降胆固醇能力与时间关系及其分析如图6。随培养时间延长，SR10沉淀降胆固醇率、同化降胆固醇率均逐渐升高，在培养过程中，胆固醇沉淀率从9.42%增加到12.8%，且同化胆固醇率从14.98%增加到20.89%。表明消化乳杆菌SR10生长过程中同时伴随胆固醇的同化作用和沉淀作用，且同化作用较沉淀作用降胆固醇更明显，菌体培养24 h后总降胆固醇率达到33.7%。

图6 不同时间段SR10菌株降胆固醇情况Fig.6 Cholesterol removal of SR10 strain at different period of time

3 讨论与结论

3.1 消化乳杆菌SR10的生理特性

消化乳杆菌SR10耐酸和耐胆盐，与Pan等［19］从马奶酒中分离得到的发酵乳杆菌特性一致。消化乳杆菌SR10与郭翔［20］从泡菜、腌制苜蓿、天然酸奶中分离得到的Lactobacillus plantarum GUO最适生长温相同;在抑菌实验中，消化乳杆菌SR10的氨苄青霉素、美满霉素，麦迪霉素，青霉素G抑菌圈较大，抑制消化乳杆菌SR10生长的作用较强，后者则对红霉素和氯霉素高度敏感。Lavanya等［21］从发酵牛奶中分离得到45株乳酸菌，约20%的菌株对卡那霉素和链霉素有抗性，70%的菌株对福利平有抗性，仅6%的菌株对杆菌肽有抗性。

消化乳杆菌SR10与其他研究中筛选得到的乳酸菌对某些抗生素敏感，但不同菌株对不同种类的抗生素敏感程度不同。发酵原料中的抗生素可能对发酵乳酸菌的生长有抑制作用，从而影响发酵原料的利用率和发酵产品的质量。

消化乳杆菌SR10的胆盐耐受力与胆盐水解酶的活性有关，胆盐水解酶能水解结合型胆盐成游离型胆盐，使胆固醇含量降低。消化乳杆菌 SR10在0.1%、0.2%的胆盐中均能正常生长，0.3%胆盐则抑制其生长。而大多数益生乳酸菌在含0.5%胆盐的PBS缓冲液中温育4 h后对胆盐还有抗性，只是乳酸菌总数有细微的降低［22］。

3.2 消化乳杆菌SR10降胆固醇作用

消化乳杆菌SR10对胆固醇的同化作用和沉淀作用在其生长过程中同时存在，且同化作用较沉淀作用降胆固醇更加明显。Gilliland等［23］提出了降胆固醇的同化理论，但Grill等［24］又提出了与同化理论相对的沉淀理论。基于不同研究结果得出的不同理论及其他的研究，人们更倾向于认为菌体降胆固醇作用是同化和沉淀共同作用的结果，但在不同的情况下，以其中的一种作用方式为主。本实验验证了酸肉中筛选的消化乳杆菌SR10的降胆固醇作用，结果表明，菌株的生长过程中伴随降胆固醇作用，且同化和沉淀作用同时存在，在整个过程中同化作用起主要作用。

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