姬旭慧，张 玲，张江波，陈丹丹，刘 媛，鲁凤民，吕全军#

1)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001 2)河南省肿瘤医院肝胆胰外科 郑州 450008 3)北京大学医学部基础医学院 北京 100191

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的消化系统恶性肿瘤之一[1-2]。目前认为，抑癌基因的功能缺失和致癌基因的激活与HCC的发生密切相关，但其分子机制尚未完全阐明[3]。染色质重塑基因ARID2位于人体12号染色体。最近的研究[4]发现ARID2在肝癌存在一定频率的突变，被认为是一个与肝癌相关的肿瘤抑制基因。作者检测了ARID2 mRNA在正常肝组织、不同肝癌细胞系、不同感染背景的肝癌组织及相应癌旁组织中的表达，尝试分析其表达的影响因素。

1 材料与方法

1.1材料来源收集河南省肿瘤医院2009年5月至2010年4月临床诊断为HCC并手术切除的标本105例，85例有HBV感染，20例无HBV或HCV感染，取其癌组织及配对癌旁正常组织(距离病变2 cm)。7例对照肝组织取自肝脏良性病变男性患者。取材均经患者同意。标本离体后立即取材，于0.5 h内冻存于液氮内。所有标本均经术后病理学确诊，患者术前未接受过放化疗。

1.2细胞、试剂和仪器9种肝癌细胞系HepG2、SNU182、Huh-7、PLC/PRF/5、SNU449、SK-Hep-1、SNU387、SMMC7721和Hep3B均由北京大学医学部病原生物学系提供。Trizol试剂(Invitrogen公司)，逆转录试剂盒(Fermentas公司)，实时荧光定量PCR试剂Light Cycler 480 SYBR Green Ⅰ Master(德国Roche公司)， RPMI 1640培养液(美国GibcoBRL公司)。实时荧光定量PCR仪(德国罗氏公司)。

1.3ARID2的mRNA表达水平检测实时定量荧光PCR扩增体系20 μL，其中罗氏Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，双蒸水8 μL，cDNA 1 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，84 ℃15 s，40个循环；最后72 ℃10 min延伸。每个样本两个平行样，取平均CT值。以CTBP为内参计算目的基因表达水平[5]。引物序列见表1。

表1 Real-time PCR扩增基因引物序列

1.4统计学处理应用SPSS 12.0分析，采用配对符号秩和检验分析癌组织和癌旁组织ARID2 mRNA的表达差异。定义癌组织与癌旁组织中ARID2 mRNA表达水平的比值<0.5为低差异表达，>2为高差异表达，介于0.5～2之间为无差异表达。不同感染背景的HCC组织ARID2 mRNA表达的比较采用Wilcoxon符号秩和检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 9种HCC细胞中ARID2mRNA的表达有HBV感染背景的5种HCC细胞(HepG2、SNU182、SNU387、SNU449、Hep3B)中ARID2 mRNA的表达水平为0.5(0.2～0.7)，无HBV感染背景的4 种HCC细胞(Huh-7、PLC/PRF/5、SMMC7721、SK-Hep-1)中的表达水平为3.8(2.2～9.7)。

2.2HCC组织中ARID2mRNA的表达有HBV感染的癌旁正常组织ARID2 mRNA的表达水平为0.5(0.2～0.7)，无HBV感染的癌旁正常组织ARID2 mRNA的表达水平为0.3(0.2～0.6)，2者均高于正常肝组织ARID2 mRNA的表达[1.2(1.1～1.6)](Z=10.684和16.015，P=0.005和0.003)。癌组织和癌旁组织中ARID2 mRNA表达的比较见表2。不同感染背景的HCC组织中ARID2 mRNA表达的比较见表3。

表2 癌组织和癌旁组织中ARID2 mRNA的表达

表3 不同感染背景的HCC组织中ARID2 mRNA表达差异的比较 例

Z=13.479,P<0.001。

3 讨论

目前对原发性肝细胞癌的诊断与治疗存在诸多难点，探索新的生物标志物为研究热点[6]。ARID2作为抑癌基因[6]，已被证实在多种肿瘤组织中存在突变。研究[5]发现ARID2在非小细胞型肺癌组织中的突变率为5%，属于高频突变基因。Li等[7]发现43例无HCV感染背景的HCC患者基因组中ARID2失活性突变率高达14%。但在有HBV感染背景的HCC，ARID2的突变率仅为0.9～2.0%[5]，提示在有HBV感染的HCC中ARID2的突变可能不是导致其作用被抑制的主要原因。该研究中ARID2 mRNA在正常肝组织和HCC癌旁组织的差异提示其发挥抑癌作用可能为早期事件。不同感染背景下的HCC细胞系ARID2 mRNA表达水平不同，有无HBV感染背景的HCC组织中ARID2 mRNA表达差异有统计学意义，提示在不同感染背景下ARID2参与HCC发生发展的通路与机制可能不同。

研究[8]显示：ARID2存在于PBAF复合物中，作为稳定SWI/SNF染色体重组复合物的必要因子，通过参与染色体重塑来抑制靶基因的转录活性。ARID2在HCC发生发展中可能通过染色体重塑的机制发挥抑癌作用，具体作用和机制尚待进一步研究。

[1]El-Serag HB, Rudolph KL. Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis[J]. Gastroenterology, 2007, 132(7): 2557

[2]El-Serag HB. Epidemiology of viral hepatitis and hepatocellular carcinoma[J]. Gastroenterology, 2012, 142(6): 1264

[3]Iakova P, Timchenko L, Timchenko NA. Intracellular signaling and hepatocellular carcinoma[J]. Semin Cancer Biol, 2011, 21(1): 28

[4]Zhao H, Wang J, Han Y, et al. ARID2: a new tumor suppressor gene in hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget, 2011, 2(11): 886

[5]Manceau G, Letouze E, Guichard C, et al. Recurrent inactivating mutations of ARID2 in non-small cell lung carcinoma [J]. Int J Cancer, 2013, 132(9): 2217

[6]Huang J, Deng Q, Wang Q, et al. Exome sequencing of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma[J]. Nat Genet, 2012, 44(10): 1117

[7]Li M, Zhao H, Zhang X, et al. Inactivating mutations of the chromatin remodeling gene ARID2 in hepatocellular carcinoma[J]. Nat Genet, 2011, 43(9): 828

[8]Yan Z, Cui K, Murray DM, et al. PBAF chromatin-remodeling complex requires a novel specificity subunit, BAF200, to regulate expression of selective interferon-responsive genes [J]. Genes Dev, 2005, 19(14):1662