俞 悦 ，王 震，穆永慧，赵伟达，韩丽娟，张 展，章 茜，杨 春#

1)郑州大学临床医学系 郑州 450052 2)郑州大学基础医学院生理学教研室 郑州 450001 3)河南大学生命科学院 开封 475004

高血压病是危害人类健康的最主要疾病之一，可对人体心、脑等靶器官造成严重损害[1]。高血压作为脑血管病的重要危险因素之一, 对认知功能的影响已经得到关注[2-3]。小电导钙激活钾通道(small conductance Ca2+-activated K+channels，SK channels)在脑组织中高表达[4]，参与神经元动作电位后电位的形成[5]，被认为与突触可塑性以及学习记忆能力密切相关[6-7]。作者利用自发性高血压(spontaneously hypertension，SH)大鼠，运用无创实验方法，探讨自发性高血压对大鼠学习记忆能力及脑组织SK2蛋白表达的影响，为深入研究自发性高血压对认知功能的影响及其相关分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组SH大鼠和对照Wistar-Kyoto(WKY) 大鼠各7只，7～8月龄，体质量200～300 g,均购自北京维通利华公司。

1.2鼠尾动脉压的测量将大鼠置于固定盒中，将尾套置于鼠尾根部，脉搏传感器传感片紧贴鼠尾下方，然后将鼠尾及尾套预热，同时等待大鼠安静，待脉搏稳定之后，使用球囊打气加压直至脉搏波呈直线，缓慢放气，待脉搏波动出现时，此时测量的尾套内气体压力即鼠尾动脉压。

1.3心电图测量大鼠经体积分数10%水合氯醛麻醉(3 mL/kg)后固定于鼠板上，将针形电极刺入四肢皮下，采用Rm6240型多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂)连续记录Ⅱ导联心电图1 h，测量P波时长、P-R间期、QRS时长、R-R间期。

1.4大鼠学习记忆能力的测试

1.4.1 Y型迷宫实验[8]Y型迷宫(张家港生物医学仪器厂)由3只短臂组成，以大鼠所在短臂为起步区，另两只短臂中随机选择一只为安全区，一只为非安全区。安全区灯泡开亮，铜栅无电流。起步区和非安全区灯泡不亮，铜栅有电流(约40 V)。控制开关打开后，安全区灯光立刻亮起，起步区和非安全区延迟2 s后通电。若大鼠在灯光亮起时能成功逃向安全区，则记为“正确”，否则记为“错误”；5 s后进行第2次操作。若连续10次中有9次正确，则视为“学会”，这10次操作之前的操作次数记为“学会次数”；若100次后仍未学会，则“学会次数”记为100。24 h后，重复此操作，若连续10次中有9次正确，则视为“记住”，这10次操作之前的操作次数记为“记忆次数”；若100次后仍未学会，则“记忆次数”记为100。

1.4.2 跳台实验 自制30 cm×30 cm×30 cm被动回避反应箱，四周用塑料板分隔，箱底为可通电的铜栅，箱底中间置一7 cm×7 cm×7 cm的绝缘泡沫正方体，作为小鼠回避电击的安全台，由一可调变压器调节电压，提供交流电。实验前将大鼠放在铜栅上，适应3 min，然后将大鼠放上平台，等大鼠跳下后再将其放回平台上，如此重复5次；然后给予持续电刺激(约40 V)，大鼠受刺激后会自动跳上平台，如此反复训练，直至大鼠在平台上一次持续停留时间超过5 min，视为“学会”。记录此过程中的“上台次数”和受电击总时间“Ta”。当20 min内仍未学会时，若上台次数大于该组中学会者的最高上台次数，则记为其“上台次数”，否则以该组学会者的最高上台次数作为其“上台次数”。24 h后，将大鼠置于跳台上，通电，记录5 min内的“下台次数”和受电击总时间“Tb”。

1.5大鼠脑组织SK2蛋白的检测迷宫和跳台实验结束后,大鼠经体积分数10%水合氯醛麻醉(3 mL/kg)后迅速断头取脑，-80 ℃冰箱储存备用。冰下从脑组织中提取蛋白，采用Western blot法检测SK2蛋白。提取的蛋白样品加入5×loading buffer，99 ℃煮沸5 min，100 g/L SDS-PAGE分离胶上样后100 V电泳3 h；取下凝胶，4 ℃恒压(100 V)电转2 h。取下PVDF膜(Bio-Rad公司)，50 g/L 脱脂牛奶-TBS室温封闭1 h，随即加入兔多克隆抗SK2抗体(按1150稀释，Sigma公司)4 ℃孵育过夜。次日，TBST洗膜，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(按15 000稀释，Thermo公司)室温孵育2 h，TBST漂洗，ECL化学发光曝光显影。

1.6统计学处理采用SAS 9.0进行统计分析。2组大鼠鼠尾动脉压、心电图参数、学习次数和记忆次数、上下台次数及Ta、Tb的比较均采用两独立样本t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组大鼠血压和心电图指标的比较见表1。

2.2 2组大鼠学习记忆能力测试结果Y型迷宫实验结果见表2，跳台实验结果见表3。

表1 2组大鼠血压和心电图指标的比较

1 mmHg=0.133 kPa。

表2 Y型迷宫实验结果

表3 跳台实验结果

2.3 2组大鼠脑组织SK2蛋白的表达见图1。SH组大鼠脑组织SK2蛋白表达高于对照组。

图1 2组大鼠脑组织SK2蛋白的表达

3 讨论

SH大鼠是用Wistar-Kyoto大鼠培育而成，出生后3个月内便能发展成为稳定的高血压;其发病机制、心血管并发症、外周血管阻力变化等都与人类高血压病相似,是目前公认的最接近于人类原发性高血压的动物模型[9]。该实验选用的SH大鼠血压较对照组大鼠明显升高，说明该模型大鼠符合高血压模型条件。同时心电图测量结果显示SH大鼠QRS时长和R-R间期延长，提示其可能有心室肥厚和缓慢性心律失常，说明高血压已经对该模型大鼠心脏造成损伤，这与人类高血压患者的心功能表现相似[10]。

认知指人体对外界事物的认识辨析能力, 是大脑高级中枢的重要功能之一。临床研究以及流行病学调查显示,长期高血压对个体的认知功能有一定程度的损伤。该研究采用Y型迷宫实验中大鼠正确反应前所需的电击次数、跳台实验中大鼠正确反应前上下台次数和受电击时间，表示其空间辨别能力和逃避条件反射能力[7]。结果证实了SH大鼠学习能力较对照组大鼠明显减退。此结果与Stocker等[5]报道的SH大鼠在诸如条件性回避反射和空间辨别等学习记忆能力降低相一致[11]。

近年来，一些研究表明，SK通道与海马学习记忆及突触可塑性有关,SK通道蛋白表达异常可导致动物认知功能障碍。Hammond等[12]研究发现，与野生型小鼠相比，SK2蛋白过表达的小鼠高频刺激后的长时程增强效应减弱，海马相关的记忆功能严重受损。Vick等[13]发现，SK通道的过表达可影响记忆编码，损害记忆。另一方面，Ballesteros-Merino等[14]研究发现，SK通道阻滞剂蜜蜂神经毒素能够选择性阻断SK通道，增加在海马信息加工处理中发挥重要作用的CA1锥体神经元的兴奋性突触后电位数量，从而异化学习记忆能力。Liegeois等[15]的研究显示，荷包牡丹碱能够有效地抑制SK通道引起的神经元后超极化，抑制神经元细胞兴奋性的减低，从而增强相关学习记忆能力。该研究发现SH大鼠脑组织SK2蛋白表达较对照大鼠增强，提示SK通道可能参与了高血压大鼠认知损害的过程，但是其作用的分子机制尚待进一步研究。

综上所述，自发性高血压可引起心脏功能异常，学习记忆能力减退， 而SK通道在学习记忆能力损害的过程中可能发挥重要作用。该研究为深入探讨自发性高血压对认知功能的影响及相关分子机制提供了实验依据。

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[6]Bond CT, Maylie J, Adelman JP. SK channels in excitability, pacemaking and synaptic integration[J]. Curr Opin Neurobiol, 2005,15(3):305

[7]Ohtsuki G, Piochon C, Adelman JP, et al. SK2 channel modulation contributes to compartment-specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells[J]. Neuron, 2012,75(1):108

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[13]Vick KA 4th, Guidi M, Stackman RW Jr. In vivo pharmacological manipulation of small conductance Ca2+-activated K+channels influences motor behavior, object memory and fear conditioning[J]. Neuropharmacology,2010,58(3):650

[14]Ballesteros-Merino C, Lin M, Wu WW, et al. Developmental profile of SK2 channel expression and function in CA1 neurons[J]. Hippocampus,2012,22(6):1467

[15]Liegeois JF, Mercier F, Graulich A, et al. Modulation of small conductance calcium-activated potassium(SK) channels: a new challenge in medicinal chemistry[J]. Curr Med Chem,2003,10(8):625