赵志鸿，侯迎迎，郑立运，王丽阳，王桂芳，张小俊，张壮丽

1)郑州大学医药科学研究院 郑州450052 2)郑州大学药学院 郑州 450001

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染至今仍是世界性的医学难题，它是导致急性、慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病因。目前临床上抗HBV的药物主要为干扰素和核苷类药物，这两类药物在HBV感染的治疗上均取得了比较好的疗效[1]，但是有报道[2-3]干扰素适应证范围窄，不良反应多；核苷类药物停药后易复发，长期使用易产生耐药性和出现肾毒性、骨髓抑制等不良反应。传统中药在长期治疗乙型肝炎中体现了独有的优势。艾叶为菊科多年生草本植物艾(ArtemisiaargyiLévl.etVant.)的干燥叶，其在我国大部分地区都有分布。传统药性理论认为艾叶有理气血、逐寒湿、温经血、安胎、杀虫止痒等[4]作用。实验[5-6]证明其具有抗菌、抗病毒、平喘镇咳祛痰、止血与抗凝血、抗过敏、镇静、护肝利胆及抗自由基等作用。作者观察了艾叶乙酸乙酯提取物对HBV的作用，报道如下。

1 材料与方法

1.1材料与仪器艾叶产自河南驻马店，由河南中医学院董诚明教授鉴定为菊科植物艾的干燥叶；HepG2.2.15细胞株由暨南大学生物医药研究开发基地赠予，作者所在的研究室自行传代培养。乙酸乙酯(分析纯，北京化工厂)，拉米夫定[葛兰素-史克制药(苏州)有限公司]，RPMI 1640培养基(北京索莱宝生物医药科技有限公司)，胰蛋白酶(美国Amersco公司)，MTT(美国Sigma公司)，G418(美国Invitrogen公司)，HBV核酸扩增荧光定量检测试剂盒(深圳匹基生物工程股份有限公司)，HBV表面抗原(HBsAg)ELISA诊断试剂盒、HBV e抗原(HBeAg)ELISA诊断试剂盒(上海科华生物技术有限公司)，DNA提取试剂盒(美国Omega公司)。生物安全柜 Hfsafe-1200TE ClassⅡ Type B2、水套式二氧化碳培养箱 HF160 W(香港力康发展有限公司)，酶标仪 168-1000XC(美国BIO RAD公司)，荧光PCR检测仪(美国Roche LightCycler1.5)，全自动灭菌器 HVE-50(日本HIRAYAMA)。

1.2艾叶乙酸乙酯提取物的制备称取粉碎后的艾叶1 kg，置于烧瓶中，加入乙酸乙酯6 000 mL，室温浸泡12 h，加热回流2 h，回流结束后静置15 min，滤过；滤渣加乙酸乙酯4 000 mL，再次回流2 h，滤过；合并滤液，减压浓缩后，于60 ℃真空干燥8 h，得艾叶乙酸乙酯提取物21.5 g。

1.3艾叶乙酸乙酯提取物对HepG2.2.15细胞毒性的测试参照文献[7]。当细胞长满培养瓶后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，加入培养液吹打成单细胞悬液，以2×104mL-1接种于96孔板，每孔100 μL，置37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养24 h，然后分别加入含0.0(对照)、1.6、8.0、40.0、200.0和500.0 mg/L艾叶乙酸乙酯提取物的RPMI 1640培养基，每个浓度设4个复孔。培养72 h后，每孔加入20 μL含结晶紫的MTT，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入200 μL二甲基亚砜充分振荡后用酶标仪(检测波长490 nm，参考波长630 nm)读取各孔吸光度(A)值，记录结果。细胞生长抑制率=(对照孔A值-给药孔A值)/对照孔A值×100%，同时计算半数毒性浓度(TC50)。

1.4艾叶乙酸乙酯提取物对HepG2.2.15细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg含量的影响选用对数生长期的HepG2.2.15细胞，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，以 2×104mL-1接种于24孔板，每孔1 mL。24 h后待细胞贴于孔底，吸去旧的培养基，分别加入含0、10、20和40 mg/L艾叶乙酸乙酯提取物的RPMI 1640培养基，每个浓度设3个复孔，并设100 mg/L拉米夫定为阳性对照。收集培养第3、6、9天的细胞上清液，于-20 ℃保存。用ELISA法测定上清液中HBsAg和HBeAg的含量，根据试剂盒的说明书操作。用酶标仪读数，选择双波长450/630 nm，读取各孔OD值，取均值，计算抑制百分率和半数抑制浓度(IC50)。

1.5艾叶乙酸乙酯提取物对HepG2.2.15细胞培养上清液中HBVDNA拷贝数的影响用荧光定量PCR法测定。用DNA提取试剂盒提取1.4中培养第9天细胞上清液中的DNA，然后使用HBV核酸扩增荧光定量检测试剂盒进行测定，均按照试剂盒说明书操作，计算抑制百分率和IC50。

1.6治疗指数(TI) TI=TC50/IC50。TI<1.0表明受试样品无效，1.0≤TI≤2.0为低效有毒即弱阳性，2.0

2 结果

2.1细胞毒性实验细胞毒性实验结果显示1.6、8.0、40.0、200.0和500.0 mg/L的艾叶乙酸乙酯提取物作用后，细胞生长抑制率分别为10.07%、17.08%、24.69%、85.39%和90.48%，TC50为104.80 mg/L。

2.2艾叶乙酸乙酯提取物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg分泌的影响3个浓度的艾叶乙酸乙酯提取物对HBsAg和HBeAg均有抑制作用。艾叶乙酸乙酯提取物作用第9天对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg分泌的IC50分别为1.26和 8.06 mg/L，见表1。

表1 艾叶乙酸乙酯提取物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg分泌的抑制率 %

2.3艾叶乙酸乙酯提取物对HepG2.2.15细胞HBVDNA拷贝数的影响作用9 d后，拉米夫定对HepG2.2.15细胞HBV DNA的抑制率为94.15%。10、20和40 mg/L艾叶乙酸乙酯提取物对HepG2.2.15细胞HBV DNA的抑制率分别为5.31%、13.46%和54.19%，IC50为38.97 mg/L。

2.4TI艾叶乙酸乙酯提取物作用第9天的TI分别为HBsAg 83.2，HBeAg 13.0，HBV DNA 2.7。

3 讨论

艾叶有护肝的作用，可降低谷丙转氨酶，恢复肝功能[8]，但抗HBV作用未见报道。HepG2.2.15细胞是当前体外筛选抗HBV药物和药物评价较好的细胞模型，该模型是通过将重组HBV DNA直接导入受体细胞而建立的转染细胞株，能长期稳定地分泌HBsAg、HBeAg和HBV，可表达HBV的全部标志，被广泛用于抗HBV药物的体外研究[9-10]。作者以HepG2.2.15细胞株作为药效评价模型，观察了艾叶乙酸乙酯提取物对HBV的抑制作用，实验中选取拉米夫定作为阳性对照药。拉米夫定是核苷类似物，临床上广泛应用于抗HBV。在细胞内，拉米夫定三磷酸盐竞争性抑制HBV聚合酶，从而抑制前基因RNA反转录为负链DNA，阻断新合成HBV DNA的链化，抑制HBV的复制，但在长期用药过程中易产生耐药性等问题。该实验结果表明艾叶乙酸乙酯提取物对HBsAg和HBeAg的抑制作用较强，而对HBV DNA的抑制作用较弱，初步判断其与拉米夫定作用机制不同。艾叶乙酸乙酯提取物可能作用于HBV的蛋白表达水平，而不在DNA的复制阶段，不会出现耐药性，如能研制成抗HBV新药，将有助于解决抗HBV临床用药耐药性的问题；对于艾叶乙酸乙酯提取物抗HBV的作用机制还需要进一步研究。

艾叶资源丰富，艾叶乙酸乙酯提取物提取工艺简便、成本低，通过深入研究，将其研制成抗HBV新药具有研究价值和应用前景。

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