薛 瑞，王明仲，洪学军，吴 倩，廉 果，何 标

原花青素(Proanthocyanidin/Procyanidin，PC)是天然植物中广泛存在的一类多酚化合物的总称，是由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成，为多酚类黄酮。近年研究显示，PC不仅可以抑制肺癌、慢性骨髓白血病、前列腺癌等肿瘤细胞的生长，还可诱导多种肿瘤细胞凋亡［1-2］。本研究旨在探讨PC对人乳腺癌MCF-7细胞的生长抑制、诱导凋亡作用，为研究开发PC作为抗乳腺癌新药提供部分实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器 人乳腺癌MCF-7细胞由华中科技大学同济医学院提供;胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司);RPMI 1640培养粉(Gibco公司);顺铂(江苏豪森药业股份有限公司);MTT和胰蛋白酶(Sigma公司);Caspase-9、Caspase-12酶联免疫检测试剂盒(GDB公司);ELx800型酶联免疫检测仪(BIO-TEK公司);CO2孵箱(JOUAN公司);流式细胞仪FACS Calibur(Becton Dickinson公司);计算机数据处理软件CELLQUEST(B.D.公司);其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 MTT法测定PC对MCF-7细胞生长的抑制作用 常规培养人乳腺癌MCF-7细胞，处于对数生长期时，常规消化、洗涤后，以1×105/mL密度接种于96孔培养板中，于5%CO2、37℃孵箱中预培养24 h后，分别加入不同浓度的PC，使最终每组含 PC 浓度分别为 10、20、40、80、160、320 μg/mL，每个浓度6个复孔，并设阳性对照药顺铂组和正常细胞组，继续培养。分别于24、48、72 h 3个时相进行MTT比色实验:每次于实验结束前每孔加入MTT，继续培养4 h后按常规采用酶标仪(波长570 nm)测定各孔吸光度值(A)。按公式“(1-药物孔A值/对照孔A值)×100%”计算细胞抑制率，以剂量和生长抑制率做直线相关分析。

1.2.2 流式细胞术检测MCF-7细胞周期和凋亡将MCF-7细胞以1×106/mL密度接种于培养瓶中，24 h后随机分组，分别加入不同浓度的PC，使最终每组含PC 浓度分别为40、80、160 μg/mL，并设阳性对照药顺铂组和正常对照组，继续培养48 h后收集细胞培养上清液，置-20℃环境待测相关基因蛋白;常规消化洗涤细胞后，用70%预冷乙醇固定细胞，置4℃环境待测凋亡率和细胞周期。检测前，先离心弃乙醇，再用PBS洗涤后置于柠檬酸缓冲液中1 h以上，调整细胞浓度至1×106/mL左右，按照试剂盒说明书操作，上流式细胞仪检测细胞凋亡率并分析细胞周期。

1.2.3 ELISA法检测凋亡相关基因蛋白Caspase-9、Caspase-12含量 采用ELISA法检测凋亡相关基因蛋白 Caspase-9和 Caspase-12含量。取“1.2.2”项中冻存的细胞培养上清液，按Caspase-9酶联免疫检测试剂盒说明书进行操作，用酶标仪(波长450 nm)测吸光度值，绘制标准曲线，并计算Caspase-9含量。同法检测Caspase-12的含量。

2 结果

2.1 PC对MCF-7细胞生长的抑制作用 置显微镜下观察，PC作用后的细胞排列稀疏，随作用时间延长和药物浓度的增加细胞密度逐渐减少。各剂量组PC对MCF-7细胞的增殖均有一定的抑制作用，抑制率与药物浓度和作用时间呈正相关。结果见图1。

图1 PC对MCF-7细胞增殖的抑制作用

2.2 PC对 MCF-7细胞凋亡的影响 40、80、160 μg/mL PC作用于MCF-7细胞后的细胞凋亡率明显高于对照组，随着剂量的增加，细胞凋亡率明显增加，并出现凋亡典型性特征峰。见表1。

表1 PC对MCF-7细胞凋亡的影响(，n=3)

表1 PC对MCF-7细胞凋亡的影响(，n=3)

注:与细胞对照组比较，*P＜0.001

组别 剂量(μg/mL) 凋亡率(%)细胞对照7.57±0.37顺铂 40 22.49±0.28*PC 40 22.37±0.31*PC 80 31.25±0.38*PC 160 53.42±0.42-*

2.3 PC对MCF-7细胞周期的影响 PC作用48 h后，细胞周期均受到不同程度的影响，与对照组相比，3个剂量组G2-M期细胞比例均显著增加(P＜0.01);且随着药物剂量的增加，G2-M期的比例也增加;G0-G1期和S期略有减少，但与对照组比较差异无统计学意义。提示PC可通过G2-M期阻滞抑制乳腺癌细胞的生长，见表2。

表2 PC对MCF-7细胞周期的作用(，n=3)

表2 PC对MCF-7细胞周期的作用(，n=3)

注:与细胞对照组比较，*P＜0.01，＊＊P＜0.001

细胞对照- 55.19±0.41 23.00±0.58 21.81±0.36顺铂 40 59.02±1.21*26.69±1.35*14.29±0.92＊＊PC 40 54.10±0.87 21.11±1.98 24.79±1.27*PC 80 52.54±0.91 21.93±2.91 25.53±1.41*PC 160 52.94±1.42 20.32±2.11 26.74±1.75*

2.4 对Caspase-9、Caspase-12蛋白表达的影响PC 3个剂量组Caspase-12蛋白表达均高于对照组(P ＜0.05 或 0.01);在 40、80 μg/mL 剂量下，PC亦促进Caspase-9蛋白表达(P＜0.01)，见表3。

表3 PC对MCF-7细胞Caspase-9、Caspase-12蛋白表达的影响

3 讨论

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，严重危害妇女健康。乳腺癌具有易复发转移的特性，部分患者在确诊时已有远处转移。原花青素作为一种天然药物，水溶性好，极易被机体吸收，生物利用度高达90%以上，具有广泛的药理作用。现代研究发现，其抗肿瘤作用较强，可选择性抑制各种肿瘤细胞的生长，但对正常组织和细胞无杀伤作用，在抗肿瘤治疗方面有巨大潜力［4］。

细胞凋亡不仅直接影响机体组织的正常发育、分化与死亡，在肿瘤治疗中的作用也已受到极大的重视［5-6］。目前认为，诱导细胞凋亡主要有Caspase依赖途径和非Caspase依赖途径，以前者为主［7-8］。而根据通路中的起始Caspase蛋白不同，Caspase依赖途径又可分为3种:①死亡受体通路，激活的Caspase-8可激活下游效应Caspase裂解多种蛋白质而最终导致细胞凋亡;②内质网介导细胞凋亡通路，Caspase-12位于内质网膜，内质网钙离子失衡或者蛋白过量表达都会诱导产生Caspase-12，同时也导致胞质的Caspase-7转移到内质网表面，Caspase-7激活 Caspase-12，激活的Caspase-12可进一步剪切Caspase-3而引发细胞凋亡;③线粒体介导细胞凋亡，线粒体中的促凋亡蛋白受到凋亡信号刺激，释放到细胞质，激活Caspase-9及下游的Caspase-3、7或6，其最终都能激活凋亡执行者Caspase-3，水解细胞成分而使细胞凋亡。

本实验分别采用MTT法和流式细胞术探讨PC对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。实验结果表明，PC能够有效杀伤乳腺癌MCF-7细胞，抑制其增殖，细胞抑制率呈浓度、时间依赖性，且细胞形态发生明显改变。PC能够明显将细胞周期阻滞在G2-M期，并可促进细胞凋亡，其在诱导MCF-7细胞凋亡的同时，基因蛋白Caspase-12表达显著增加，中、低浓度时也可诱导Caspase-9表达增加，提示PC抑制人乳腺癌MCF-7细胞的作用机制与阻滞细胞周期于G2-M期和诱导细胞凋亡有关，该细胞凋亡诱导途径与Caspase有关，可能涉及Caspase家族的内质网和线粒体2条激活通路。细胞凋亡激活信号通路十分复杂，不同信号分子之间相互联系［9］，有待进一步研究。

［1］Mitsunaga T.Anti-caries activity of bark proanthocyanidins［J］.Basic Life Sci，1999，66:555-573.

［2］Vayalil PK，Mittal A，Katiyar SK.Proanthocyanidins from grape seeds inhibit expression of matrix metalloproteinases in human prostate carcinoma cells，which is associated with the inhibition of activation of MAPK and NF kappa B［J］.Carcinogenesis，2004，25(6):987-995.

［3］Smart DJ，Halicka HD，Traganos F，et al.Ciprofloxacin induced G2 arrest and apoptosis in TK6 lymphoblastoid cells is not dependent on DNA double-strand break formation［J］.Cancer Biol Ther，2008，7(1):113-119.

［4］Wu L，Huang Z，Qin P，et al.Chemical characterization of a procyanidin-rich extract from sorghum bran and its effect on oxidative stress and tumor inhibition in vivo［J］.Agric Food Chem，2011，59，8609-8615.

［5］王炎，李琦，范忠泽，等.丹参酮ⅡA介导p38 MAPK信号转导诱导人肝癌细胞凋亡［J］.世界华人消化杂志，2009，17:124-129.

［6］Lee SK，Kim HN，Kang YR，et al.Obovatol inhibits colorectal cancer growth by inhibiting tumor cell proliferation and inducing apoptosis［J］.Bioorg Med Chem，2008，16:8397-8402.

［7］Vaidya S，Velázquez-Delgado EM，Abbruzzese G，et al.Substrate-induced conformational changes occur in all cleaved forms of caspase-6［J］.J Mol Biol，2011，406(1):75-91.

［8］Reuter S，Eifes S，Dicato M，et al.Modulation of anti-apoptotic and survival pathways by curcumin as a strategy to induce apoptosis in cancer cells［J］.Biochemical Pharmacology，2008，76:1340-1351.

［9］杨洁，邓子鲲，朱彤阳，等.肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体临床治疗应用前景［J］.世界临床药物，2012，33(2):105-115.