那 迪，姜成钢，徐 昊，徐 岩，王振宁，徐惠绵

腹膜转移是影响胃癌手术预后的重要原因之一，是否转移直接关系术后生存率［1］。腹膜转移会显著加剧胃癌晚期的进程及恶化程度，然而转移的机制仍不十分明晰。腹膜为癌细胞转移提供了所需的炎性介质，在癌腹膜转移早期，由癌细胞、成纤维细胞、间皮细胞等分泌的细胞因子作用于间皮细胞，使间皮细胞在形态结构功能上发生改变，为腹膜转移提供“土壤”［2］。间皮细胞通过抵御肿瘤释放的因子来阻止肿瘤细胞浸润［3］。在对癌细胞浸润间皮细胞的研究中，Buck等把Walker 256癌细胞接种到间皮细胞受损的小鼠腹腔内后，观察到癌细胞在受损区域迅速种植生长，而间皮细胞完好的小鼠却很少发生转移［4］。推测胃癌细胞可以破坏腹膜间皮细胞，从而形成腹膜转移，而黄芪具有抗肿瘤作用［5］，可间接保护腹膜间皮细胞。基于上述假设，笔者拟建立胃癌细胞对腹膜间皮细胞的损伤模型，并检测黄芪对腹膜间皮的保护作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料 试剂:黄芪提取液购自正大青春宝公司;MTT、33258染料购自Sigma公司;FCS、DMEM、PI均购自Biosharp公司。细胞系:人胃癌细胞株MKN45由中国医科大学细胞生物教研室提供。人腹膜间皮细胞系由中南大学湘雅二院彭佑铭教授馈赠(细胞株由法国巴黎TENON医院Pierre RONCO教授建立)。

1.2 方法

1.2.1 光镜下人腹膜间皮细胞形态学变化 人腹膜间皮细胞系用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养液，在37℃、5%CO2饱和湿度的条件下培养，至生长到对数期分3组:对照组为只加DMEM培养液的间皮细胞;实验组1为间皮细胞加胃癌MKN45细胞上清;实验组2为间皮细胞加胃癌MKN45细胞上清与黄芪提取液共培养。光镜下观察作用24 h后腹膜间皮细胞形态学变化。

1.2.2 MTT检测黄芪作用后人腹膜间皮细胞生长曲线 分组同上。分别于共培养12、24、48 h后加入MTT，继续培养4 h，吸除孔内液体，每孔加入DMSO 150 μL，震荡 10 min，酶标仪检测 490 nm波长处各孔的吸收度，检测间皮细胞存活率，并绘制生长曲线。存活率=实验组光吸收值/对照组光吸收值×100%。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 分组同上，培养24、48 h后用0.25%胰蛋白酶适度消化细胞，离心，分别制备各组单细胞悬液。移入新的1.5 mL离心管中，4℃ 500×g，离心5 min，形成细胞团。小心移去上清液，冰预冷PBS洗细胞2次，保证每管细胞数至少106个细胞，上机检测，检测细胞凋亡率。

1.2.4 荧光显微镜观察间皮细胞凋亡情况 将盖玻片置于6孔板底，间皮细胞(1×106/孔)接种过夜，分组同上。黄芪提取液浓度为100 μg/mL，作用24 h，PBS洗2次，加入固定液(甲醇与冰乙酸的体积比为3∶1)固定15 min，PBS洗2次，加Hoechst 33258荧光染料(0.5 mL)，37℃避光孵育20 min，荧光显微镜下观察，照相。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0统计学软件，应用Student's t-检验进行统计分析，结果以表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜下腹膜间皮细胞形态学改变 对照组间皮细胞呈多边形，排列完整，连续单层铺路石样特征(图1A)。而接触胃癌上清后的间皮细胞变小，形状不规则，细胞连接松散，有的区域细胞大面积脱落形成暴露区(图1B)。胃癌上清与黄芪提取液共培养组可见细胞数目较单纯胃癌上清组增多，较致密，偶见细胞脱落，未见大面积裸露区(图1C)。

图1 光镜下腹膜间皮细胞形态学改变

2.2 MTT检测黄芪对人腹膜间皮细胞保护作用实验组1与实验组2于24、48 h间皮细胞存活率分别为47.32%、19.81%，67.25%、34.11%。各组间比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。见图2。

图2 不同时间点胃癌上清单独或联合黄芪作用下间皮细胞存活率比较

2.3 流式细胞仪检测黄芪提取液培养的间皮细胞对胃癌细胞上清的抵御作用 对照组与实验组1、实验组2在24、48 h凋亡率分别为12.45% ±7.42%、24.96% ±9.17%，54.10% ±14.19%、82.70% ±31.22%，38.20% ±4.23%、52.20% ±7.54%。两组在各时间点的凋亡率比较差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。

表1 不同时间点胃癌上清单独或联合黄芪提取液作用下间皮细胞凋亡率比较(%)

2.4 Hoechst 33258荧光染色观察间皮细胞凋亡在胃癌上清作用24 h后间皮细胞发生明显改变，间皮细胞大量脱落，可见核溶解、碎裂、核固缩等凋亡特征(图3A)。黄芪提取液与胃癌上清共同作用24 h后，比胃癌上清单独作用组凋亡的细胞量明显减少，间皮细胞排列规则，偶见凋亡特征(图3B)。

图3 Hoechst 33258荧光染色观察间皮细胞凋亡变化(荧光显微镜×200)

3 讨论

研究表明，胃癌细胞可以通过对间皮细胞的破坏来达到腹膜转移的目的，Paget提出了“种子-土壤”学说，即腹膜成为胃癌细胞种植适宜的“土壤”［6-7］。本实验通过光镜观察发现，胃癌细胞上清作用间皮细胞后，间皮细胞体积变小，形态不规则，细胞连接松散，甚至出现大面积脱落。MTT检测发现，胃癌上清作用后，间皮细胞存活率显著下降，说明胃癌细胞具有抑制间皮细胞生长、促进其凋亡作用。流式细胞仪检测继而发现，细胞凋亡率在胃癌上清作用前后差异有统计学意义(P＜0.01)，说明间皮细胞凋亡在胃癌腹膜转移中广泛存在。Hoechst 33258荧光染色从形态学显示，胃癌上清作用后间皮细胞出现典型凋亡特征，如核固缩、核溶解、核碎裂，甚至细胞大片缺失，出现“真空区”。

黄芪有对抗毒素B1诱发癌变的作用，可增加环磷酰胺CTX抗癌活性，并促进因CTX所致机体造血功能损伤的恢复。黄芪总黄酮TFA可降解细胞脂质过氧化物生成，阻断自由基的链式反应，防止细胞损伤和致突变，从而发挥抗癌作用。王晓瑜等［8］报道，黄芪提取液可通过调节花生四烯酸系统的代谢而诱导肿瘤细胞周期停滞，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤新生血管生成，防御肿瘤侵袭和转移，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性等机制发挥其抗肿瘤作用。基于以上理论，本研究将黄芪提取液与胃癌上清共培养，作用于间皮细胞，观察其通过抑制胃癌细胞作用而对间皮细胞的保护作用。

光镜观察到黄芪提取物与胃癌细胞上清共同作用间皮细胞后，间皮细胞体积比正常间皮细胞稍变小，形态规则，细胞连接比较紧密，少量细胞缺失，但未出现大面积脱落区，比胃癌上清作用组改善明显。MTT实验中，胃癌上清组与间皮细胞组存活率比较差异有统计学意义(P＜0.05)，说明黄芪可抑制胃癌细胞对间皮细胞的破坏，起到保护作用。流式细胞检测中，胃癌上清组及共培养组24、48 h凋亡率比较差异有统计学意义(P＜0.05)。说明黄芪可保护间皮细胞呈时间依赖性。共培养组未出现特征性凋亡改变，只是细胞数较正常组稍减少，但未见裸露区，从形态学直观说明黄芪具有抑制肿瘤的促凋亡作用，为临床用药提供依据。本研究首次证明黄芪能够保护腹膜间皮细胞，间接证明其具有抑制胃癌细胞的促凋亡作用，在未来胃癌腹膜转移的治疗与预防中应用前景广阔，其作用机制尚待进一步研究。

［1］Heath RM，Jayne DG，O'Leary R，et al.Tumour-induced apoptosis in human mesothelial cells:a mechanism of peritoneal invasion by Fas Ligand/Fas interaction［J］.Br J Cancer，2004，90(7):1437-42.

［2］Yashiro M，Chung YS，Nishimura S，et al.Fibrosis in the peritoneum induced by scirrhous gastric cancer cells may act as“soil”for peritoneal dissemination［J］.Cancer，1996，77(8 Suppl):1668-1675.

［3］Catalan MP，Subirád，Reyero A，et al.Regulation of apoptosis by lethal cytokines in human mesothelial cells［J］.Kidney Int，2003，64(1):321-330.

［4］Leard LE，Broaddus VC.Mesothelial cell proliferation and apoptosis［J］.Respirology，2004，9(3):292-299.

［5］刘跃华，黄静，王雍，等.注射用黄芪多糖联合化疗治疗中晚期胃癌的疗效［J］.实用医学杂志，2011，27(3):516-518.

［6］Yashiro M，Chung YS，Inoue T，et al.Hepatocyte growth factor(HGF)produced by peritoneal fibroblasts may affect mesothelial cell morphology and promote peritoneal dissemination［J］.Int J Cancer，1996，67(2):289-293.

［7］Kosaka K，Yashiro M，Sakate Y，et al.A synergistic antitumor effect of interleukin-2 addition with CD80 immunogene therapy for peritoneal metastasis of gastric carcinoma［J］.Dig Dis Sci，2007，52(8):1946-1953.

［8］王晓瑜，龙汉安.黄芪及黄酮类成分防治肿瘤作用的研究进展［J］.华西医学，2011，26(2):297-300.